馬瑞娟，周 鳳，田豆豆，張 薇，張科東

（1.寧夏醫(yī)科大學，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004；3.廣州醫(yī)科大學國家呼吸疾病重點實驗室，廣州 511495）

呼吸道黏液是呼吸道第一道防御屏障的重要組成部分，在保持呼吸道濕潤、俘獲外來物質(zhì)、防止機械損傷以及協(xié)助呼吸道上皮細胞功能等方面起著重要作用。當黏液分泌過度或黏滯性增加時，往往會阻塞呼吸道管腔，誘發(fā)支氣管及肺部感染。黏液的黏性和彈性主要取決于黏蛋白的含量及活性。羧甲司坦（carbocisteine，CAR）是臨床上常用的呼吸道黏液溶解劑，能夠還原黏蛋白二硫鍵，降低其黏滯性，使得各種呼吸系統(tǒng)炎性反應形成的呼吸道黏液易于排出。本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，CAR能夠抑制香煙提取物（CSE）誘導的人肺泡上皮A549細胞的炎性反應，故推測CAR除了協(xié)助呼吸道黏液排出，也具有一定的抗炎作用。因此，本研究建立體內(nèi)外模型，旨在探索CAR能否抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠急性呼吸道炎癥（acute respiratory inflammation，ARI）反應，為后續(xù)呼吸道感染的臨床研究提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺泡上皮A549細胞系（中科院上海細胞庫），“紅玫”牌香煙（廣東中煙工業(yè)有限公司），CAR粉劑（純度≥99%）（廣州白云山制藥），LPS（美國Sigma公司），小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、黏蛋白5AC（Muc5AC）檢測試劑盒（美國eBioScience公司），酶標儀及CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）。6～8周齡健康無特定病原體（SPF）級雄性C57BL/6j小鼠（廣東省醫(yī)學實驗動物中心）。動物實驗獲得廣州醫(yī)科大學動物管理和使用委員會批準［批準號：SCXK（粵）2018-0008］。

1.2 細胞實驗

10%FBS-DMEM常規(guī)培養(yǎng)A549細胞，氣體采樣管（大包氏管）采集香煙主流煙霧，收集CSE，濾除細菌及顆粒，形成100%CSE，30 min內(nèi)進行后續(xù)實驗，本實驗所需濃度為3%。香煙提取物刺激A549細胞后形成細胞模型。實驗分為正常對照（CTL）組、CAR組、CSE組及CAR+CSE組。按照試劑盒說明經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6及Muc5AC的含量。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗分組 32只6～8周齡雄性C57BL/6j小鼠被隨機分為CTL組、LPS組、CAR組、LPS+CAR組，每組8只。

1.3.2 小鼠ARI模型復制及CAR處理 根據(jù)文獻[1]的方法，1%戊巴比妥麻醉小鼠后，按照1 mg·kg-1的劑量經(jīng)鼻腔滴入LPS溶液（LPS組），CTL組滴入等量生理鹽水。LPS+CAR組小鼠，在滴入LPS溶液后按100 mg·kg-1劑量腹腔注射CAR溶液。正常小鼠腹腔注射等劑量CAR溶液即為CAR組。24 h后采集相應的標本，提取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。

1.3.3 BALF中炎性細胞測試 收集BALF沉淀細胞，裂解去除紅細胞，進行細胞計數(shù)。剩余細胞沉淀涂片，4%多聚甲醛固定，蘇木素-伊紅（HE）染色，進行巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞分類及計數(shù)。

1.3.4 ELISA檢測 收集去雜質(zhì)的細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測細胞上清中Muc5AC含量，按照處理組/正常對照組×100%的公式計算細胞培養(yǎng)上清中Muc5AC的相對含量。收集ARI小鼠BALF，離心去除細胞雜質(zhì)后按照試劑盒說明，檢測BALF中TNF-α及IL-6的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CAR抑制CSE刺激下的A549細胞分泌炎性因子TNF-α和IL-6

ELISA測定細胞上清液中炎性因子的含量，與CTL組相比，CSE組的TNF-α、IL-6水平均升高（P均＜0.05），給予CAR處理后，CSE+CAR組的TNF-α和IL-6水平均下降（P均＜0.05），見圖1。

圖1 CAR抑制CSE刺激下的A549細胞分泌炎性因子TNF-α及IL-6

2.2 CAR抑制CSE刺激下A549細胞分泌Muc5AC的水平

ELISA結果顯示，與CTL組相比，CSE組細胞培養(yǎng)液中Muc5AC水平升高，CSE+CAR組Muc5AC的水平降低（P均<0.05），見圖2。

圖2 CAR抑制CSE刺激下A549細胞分泌Muc5AC的水平

2.3 CAR對ARI小鼠BALF中白細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)量的影響

CTL組小鼠BALF中白細胞數(shù)較少，以淋巴細胞為主。CAR組對BALF細胞數(shù)量及比例無影響。與CTL組相比，LPS組小鼠BALF中白細胞數(shù)與中性粒細胞數(shù)均增加（P均<0.01）；與LPS組相比，LPS+CAR組小鼠BALF中白細胞數(shù)及中性粒細胞總數(shù)均減少（P均<0.05），見圖3。

圖3 CAR對ARI小鼠BALF中白細胞數(shù)及中性粒細胞數(shù)量的影響

2.4 CAR對ARI小鼠BALF中炎性因子TNF-α及IL-6分泌的影響

LPS組BALF中TNF-α及IL-6的水平均高于CTL組（P均<0.01）；LPS+CAR組BALF中TNF-α及IL-6水平均低于LPS組（P均<0.01），見圖4。

圖4 CAR對ARI小鼠BALF中TNF-α及IL-6分泌的影響

3 討論

呼吸道感染是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為炎性介質(zhì)釋放以及呼吸道分泌物反應性增多等。盡管黏液在維持呼吸道屏障中具有重要作用，但分泌過度或理化性質(zhì)發(fā)生改變時，往往會阻礙正常的氣體交換。CAR是常用的黏痰溶解劑，其結構中包括的巰基可結合活性氧的親電子基團，消滅氧自由基，促進還原型谷胱甘肽生成，還原黏液主要成分黏蛋白二硫鍵，破壞其空間結構，降低黏滯性，使得痰液易于排出[2]。當前有關CAR的應用主要集中在抑制慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張等慢性呼吸道炎癥性疾病的發(fā)生中[3-4]，關于其在ARI中的直接抗炎作用鮮有報道。有報道[5]提示，CAR能夠降低流感病毒等病原體對呼吸道上皮細胞的損害，表現(xiàn)出一定的抗炎效果。課題組前期的研究[6]結果亦提示，CAR可以降低急性肺損傷小鼠呼吸道Muc5AC的分泌。然而CAR調(diào)節(jié)Muc5AC與炎性介質(zhì)分泌的關系并不清楚。本研究證實了正常組細胞培養(yǎng)液中Muc5AC分泌程度低，而且單純CAR并不會影響A549細胞中Muc5AC的分泌。和CTL組相比，CSE暴露下的細胞培養(yǎng)上清中Muc5AC分泌量增加，CAR可以降低CSE刺激引起的Muc5AC的上調(diào)。黏液的增多或減少是臨床評價感染是否有效控制的重要指標。正常情況下，呼吸道黏膜上覆蓋黏液層，形成一道可靠的防護屏障，可分隔各種有害物質(zhì)及致病微生物，并經(jīng)纖毛有節(jié)律的擺動來排除異物。在急慢性呼吸道炎癥中，可出現(xiàn)上皮細胞增生、腺體肥大或增生，或杯狀細胞化生，導致黏液分泌明顯增加，接連不斷地呼吸道黏液異常分泌以及流變學特征的變化會引起呼吸道纖毛清除能力下降、消失，使細菌容易定植在此處，甚至產(chǎn)生炎性改變，還會導致支氣管中小呼吸道阻塞、氣流不通暢、氣體交換功能受阻等，最終使得呼吸道炎癥長久不愈[7]。課題組前期的另一項報道[8]提示，LPS可以通過增加TNF-α的分泌從而促進另一種黏蛋白（Muc1）的分泌，通過調(diào)節(jié)TNF-α受體來降低Muc1的分泌程度。盡管CAR的藥物機制是通過破壞黏蛋白構象促進其排出，但是細胞實驗和動物實驗均提示CAR抑制了急慢性炎癥環(huán)境下的黏蛋白表達。因此推測其降低CSE或LPS所致的Muc5AC分泌的機制可能與其抗氧化作用下調(diào)炎性因子TNF-α和IL-6等有關，后兩者正是促進Muc5AC表達的正性調(diào)控分子[9]。

A549細胞系是研究呼吸道及肺實質(zhì)病變最常用的細胞[10]。TNF-α和IL-6的表達或分泌與多種炎癥密切相關，可有效反映體內(nèi)或體外的總體炎性水平[11-12]。本研究的細胞實驗用CSE刺激A549細胞，通過檢測細胞培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)炎性因子TNF-α和IL-6的表達升高。CAR能夠抑制CSE誘導的TNF-α和IL-6的分泌，其抗炎作用可能與抑制Muc5AC表達有關。

本研究細胞實驗和動物實驗均表明，CAR能夠抑制炎性反應，提示CAR除了能夠破壞黏蛋白構象、促進黏液溶解易于排出外，還可抑制呼吸道上皮炎性反應，進而抑制黏蛋白表達和分泌。