馬 雯，李 芹，郭 媛，何瑞芬，樸文花

（1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中心，銀川 750002；2.西北民族大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系，銀川 750002）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，是肝硬化發(fā)生的主要原因之一。全球30%以上的肝硬化病例與HBV感染有關(guān)，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1]。維生素D是一種類固醇激素，在體內(nèi)可調(diào)節(jié)鈣磷水平，確保骨骼正常生長(zhǎng)。研究[2]表明，維生素D具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠參與細(xì)胞增殖、分化、免疫與抗炎等。近年來，維生素D在肝硬化發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。維生素D可調(diào)節(jié)肝炎病毒的復(fù)制，減緩肝硬化的進(jìn)程，還可通過與免疫細(xì)胞上的特異性維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）結(jié)合，直接或間接作用于肝硬化患者的淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞，抑制其增殖、分化功能，發(fā)揮其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用[3]。因此本研究旨在通過分析乙肝肝硬化患者血清維生素D、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、乙肝病毒脫氧核糖核酸（hepatitis B virus nucleic acid，HBV DNA）、Child-Pugh評(píng)分及淋巴細(xì)胞亞群比例，探討維生素D與乙肝肝硬化患者肝功能及免疫功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院2018年1月至2020年12月門診及住院首次診斷乙肝肝硬化且尚未開始臨床抗病毒及其他治療的患者89例，其中男性46例，女性43例。所有患者乙肝表面抗原（HBsAg）均為陽(yáng)性，且符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[4]中乙型肝炎肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除其他病毒性肝炎、酒精性肝炎以及慢性肝病導(dǎo)致的肝硬化者，無合并急慢性感染、冠心病、糖尿病、腎臟疾病等患者；排除近12個(gè)月服用過維生素D制劑及影響維生素D生成及吸收的相關(guān)疾病者；排除孕產(chǎn)婦及哺乳期、備孕期婦女。Child-Pugh評(píng)分參照《肝硬化診治指南》[5]要求：A級(jí)為5～6分，B級(jí)為7～9分，C級(jí)為10～15分。選擇同期我院健康管理中心92例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性47例，女性45例。使用深圳雙佳SK-CK超聲波體檢機(jī)測(cè)量入組患者的身高、體質(zhì)量及身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI），并統(tǒng)計(jì)每周運(yùn)動(dòng)情況。

1.2 標(biāo)本采集與處理

采集患者空腹靜脈血標(biāo)本，EDTA-K2抗凝全血用于淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，血清標(biāo)本用于乙肝五項(xiàng)、維生素D、ALT、AST、ALB、TBIL及HBV DNA的檢測(cè)。

1.3 儀器與試劑

乙肝五項(xiàng)采用美國(guó)雅培i4000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控品檢測(cè)。血清維生素D使用德國(guó)西門子公司ADVIA Centaur XP免疫發(fā)光分析儀及配套試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控品檢測(cè)。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會(huì)發(fā)布的《維生素D及其類似物臨床應(yīng)用共識(shí)》規(guī)定，維生素D＞30 ng·mL-1為維生素D充足，20～30 ng·L-1為維生素D不足，＜20 ng·mL-1為維生素D缺乏[6]。血清ALT、AST、ALB及TBIL使用德國(guó)西門子公司ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控品檢測(cè)。HBV DNA使用德國(guó)凱杰Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。試劑由湖南圣湘生物科技有限公司提供，試劑盒最低檢出值為30 IU·mL-1，定量檢測(cè)線性范圍為1.0×102～5.0×109IU·mL-1。外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)使用美國(guó)Becton Dickson公司生產(chǎn)的FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)試劑（貨號(hào)662966）、溶血素、鞘液均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickson公司。該試劑盒含有FITC標(biāo)記的CD3，克隆SK7；CD8藻紅蛋白（PE），克隆SK1，CD4別藻藍(lán)蛋白（APC），克隆SK3。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，正態(tài)分布資料組間比較采用成組t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的資料采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，組間每周運(yùn)動(dòng)情況比較采用卡方分層法，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。乙肝肝硬化患者不同維生素D組間比較使用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Brown-Forsythe檢驗(yàn)，并使用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，圖表使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行繪制。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

兩組患者性別、年齡、身高、體質(zhì)量、BMI及每周戶外運(yùn)動(dòng)情況間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），乙肝肝硬化組維生素D含量低于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。乙肝肝硬化組維生素D充足者13例、維生素D不足者24例、維生素D缺乏者52例，不同維生素D水平患者年齡、身高、體質(zhì)量、BMI及每周戶外運(yùn)動(dòng)情況間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

表1 對(duì)照組和乙肝肝硬化組患者一般資料比較

表2 不同維生素D水平乙肝肝硬化患者一般資料比較

2.2 乙肝肝硬化組患者維生素D與肝功能相關(guān)性分析

ALT、AST、TBIL及HBV DNA指標(biāo)與維生素D均無相關(guān)性（P均＞0.05），ALB與維生素D呈正相關(guān)（r=0.214，P=0.044），Child-Pugh評(píng)分與維生素D呈負(fù)相關(guān)（r=-0.300，P=0.004），見圖1。

圖1 乙肝肝硬化患者維生素D與肝功能相關(guān)性分析

2.3 不同維生素D水平乙肝肝硬化患者淋巴細(xì)胞亞群比較

乙肝肝硬化不同維生素D水平患者外周血CD3+T細(xì)胞百分比和CD4+T細(xì)胞百分比組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。CD8+T細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。維生素D不足者、缺乏者與充足者相比，CD8+T細(xì)胞百分比增加（P均＜0.01），而CD4+/CD8+比值降低（P＜0.05），見表3。

3 討論

乙肝肝硬化是HBV感染并進(jìn)一步發(fā)展為肝臟彌漫性纖維化、假小葉形成、肝內(nèi)外血管增殖的終末階段。機(jī)體免疫細(xì)胞在清除乙肝病毒的同時(shí)不斷地?fù)p傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致正常肝細(xì)胞外基質(zhì)降解、纖維瘢痕組織聚集、血管扭曲變形以及多種細(xì)胞因子釋放，使患者出現(xiàn)門靜脈高壓、循環(huán)障礙、腹腔積液、黃疸、消化道出血及肝性腦病等癥狀，給患者和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。研究[7]表明，處于肝硬化階段的患者常表現(xiàn)出不同程度的免疫功能紊亂，尤其是細(xì)胞免疫失調(diào)。作為具有免疫調(diào)節(jié)功能的類固醇激素，維生素D在乙肝肝硬化的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

維生素D的含量與年齡、性別、生活方式以及日照強(qiáng)度等均有關(guān)系，本研究中乙肝肝硬化組血清維生素D含量低于對(duì)照組，且有85.4%的乙肝肝硬化患者出現(xiàn)了維生素D不足，提示乙肝肝硬化患者存在普遍且嚴(yán)重的維生素D缺乏。維生素D在生成過程中需要在肝臟中進(jìn)行羥基化，因此肝細(xì)胞的損失必然導(dǎo)致維生素D合成的異常。另外，活性維生素D生成后需要與VDR結(jié)合，經(jīng)維生素D結(jié)合蛋白運(yùn)輸?shù)桨衅鞴俨拍馨l(fā)揮生理作用，但肝硬化階段肝細(xì)胞合成能力下降，使維生素D的運(yùn)輸受到限制，進(jìn)而導(dǎo)致外周血維生素D減少。近93%的慢性肝臟疾病患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的維生素D缺乏，維生素D的缺乏與感染、并發(fā)癥的發(fā)生、肝臟纖維化程度及病死率的增加均有關(guān)聯(lián)[3，8]。本研究也發(fā)現(xiàn)，乙肝肝硬化患者血清維生素D含量與ALB含量呈正相關(guān)，與Child-Pugh評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與ALT、AST、TBIL及HBV DNA含量無線性關(guān)系。ALB的含量可以反映肝臟細(xì)胞的合成能力，進(jìn)一步提示維生素D的含量與肝臟合成功能相關(guān)。另有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，慢性肝臟疾病患者血清維生素D含量與Child-Pugh評(píng)分存在負(fù)相關(guān)性，并證實(shí)補(bǔ)充維生素D后患者預(yù)后好于對(duì)照組。本研究未發(fā)現(xiàn)維生素D與ALT、AST及TBIL之間存在相關(guān)性，與相關(guān)報(bào)道一致[11]。HBV DNA定量結(jié)果能夠反映患者感染后乙肝病毒在體內(nèi)的復(fù)制情況，是治療過程中重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Ko等[12]發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者HBV DNA與維生素D濃度呈負(fù)相關(guān)，高文等[13]稱維生素D與HBV DNA含量無相關(guān)性，與本研究結(jié)果相同，因此考慮需要增加乙肝肝硬化臨床病例的收集，擴(kuò)大樣本量對(duì)此結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

在乙肝病毒感染肝細(xì)胞并導(dǎo)致肝硬化的過程中，維生素D可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮作用。研究表明，維生素D可參與T細(xì)胞協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體并誘導(dǎo)粒細(xì)胞趨化，還能協(xié)助抗原提呈并產(chǎn)生多種細(xì)胞因子完成病毒的清除[12]。本研究中，依照維生素D含量對(duì)乙肝肝硬化患者分組比較，雖未觀察到CD3+T細(xì)胞百分比和CD4+T細(xì)胞百分比組間的顯著性差異，但仍可見乙肝肝硬化患者體內(nèi)隨維生素D減少會(huì)出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞總數(shù)的下降，后續(xù)需要對(duì)此結(jié)果再次深入探究。CD8+T細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且維生素D不足者、缺乏者與充足者比較后發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞百分比增加，CD4+/CD8+比值減少，說明乙肝肝硬化患者免疫細(xì)胞比例失調(diào)，且維生素D濃度與患者體內(nèi)的免疫功能紊亂存在一定的聯(lián)系。有報(bào)道[12]稱，維生素D能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向受損且炎性反應(yīng)較重的肝組織遷移，從而改善機(jī)體的損傷。同時(shí)，高濃度的維生素D可進(jìn)一步抑制適應(yīng)性免疫和CD8+T細(xì)胞的增加，從而減輕炎性反應(yīng)，與本研究結(jié)果類似。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均已證實(shí)，維生素D可通過與VDR的結(jié)合，參與CD4+T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-2、γ干擾素（IFN-γ）及IL-17等，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)[14]。由此可見，維生素D發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)，不僅能夠?qū)γ庖呒?xì)胞數(shù)量或免疫細(xì)胞比例產(chǎn)生影響，還能進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

乙肝肝硬化患者維生素D與肝細(xì)胞功能及細(xì)胞免疫的相關(guān)性已被證實(shí)，并有研究認(rèn)為維生素D與乙肝肝硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)[11，15]，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步深入探究。近年來，對(duì)肝硬化過程中VDR、VDR基因多態(tài)性以及維生素D結(jié)合蛋白的研究也從另一個(gè)角度闡明了維生素D免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)機(jī)制[16-17]，為今后乙肝肝硬化的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了新的思路。