李佳琪，馬淑琴，趙 楓，付有娟，姚貴香，關素珍

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，銀川 750004；2.寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004）

我國女性勞動參與率較高，女性的職業(yè)健康受到了越來越多的關注[1]，尤其是女性在妊娠期的特殊生理時期會面臨來自工作、生活、社會中各種不良應激事件的心理刺激，不僅對孕婦本身的身體健康產(chǎn)生影響[2]，還會導致宮內環(huán)境發(fā)生改變從而不利于胎兒發(fā)育及后期的成長[3]。腸道菌群（gut microbiota）是腸道特有的微生物群落，通過產(chǎn)生微生物及其代謝物進而影響多種代謝和免疫穩(wěn)態(tài)的功能[4]。孕期應激已被證實可對子代的腸道菌群結構產(chǎn)生影響[5]，但要深入了解腸道菌群和宿主之間的復雜關系，不僅需要了解其結構和功能，還需要進一步了解腸道菌群與代謝物之間的聯(lián)系，其中短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝物能夠反映宿主的代謝情況[6]。因此，本研究通過建立孕期慢性應激大鼠模型，觀察孕期應激致仔鼠腸道菌群結構和靶向代謝物短鏈脂肪酸改變，分析子代腸道菌群與短鏈脂肪酸的關系，進而為孕期應激對子代發(fā)育影響的機制研究提供科學依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 實驗動物及分組

本研究選擇健康成年SD大鼠，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心［合格證編號：SCXK（寧）2015-0001］。其中雌鼠16只，體質量（200±20）g；雄鼠12只，體質量（200±20）g。適應性飼養(yǎng)1周后，將雌鼠隨機分為孕期慢性應激組（模型組）和對照組，每組各8只；將12只雄鼠隨機分為模型交配組8只和對照交配組4只。其中模型組雌鼠單籠飼養(yǎng)，對照組雌鼠每籠2只飼養(yǎng)；雄鼠每籠2只飼養(yǎng)。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審核（IACUCNYLAC-2019-089）。

1.2 主要儀器與試劑

131I皮質醇放射免疫試劑盒（北京北方生物技術研究所）；Illumina Miseq PE300測序平臺（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）；8890B-5977B氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent Technologies公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型構建 （1）模型選擇：選擇慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立動物模型。應激方式包括：①禁食24 h；②24 h擁擠環(huán)境（8只合籠），籠具傾斜30°；③禁水24 h；④24 h潮濕環(huán)境（濕度60%～70%）；⑤31℃溫水游泳1 h；⑥30 min搖晃（1次/s）；⑦30 min行為束縛；⑧5 min熱應激（42℃）；⑨1 min夾尾（距尾尖1 cm處）。模型周期為21 d，期間9種應激方式隨機安排，原則上7 d內不出現(xiàn)相同的應激方式。應激①②③④在24 h進行，其余均在當天10：00～12：00進行。應激完成后放回原飼養(yǎng)籠具中。（2）交配過程：模型組在應激第3天（17：00）與模型交配組1∶1合籠飼養(yǎng)，第2天早晨檢查雌鼠陰道涂片確認妊娠成功與否，確定妊娠后，將雌雄分籠，模型組繼續(xù)單籠飼養(yǎng)。孕期每天對模型組實施不同的慢性溫和刺激。同期，對照組與對照交配組2∶1合籠飼養(yǎng)，確定妊娠后，對照組每籠2只正常飼養(yǎng)，孕18 d開始單籠飼養(yǎng)。

1.3.2 指標的測定（1）孕期CUMS模型確認：所有雌鼠在應激前1 d，應激第1、7、14、21天行內眥靜脈采血，將收集的血漿置于-80℃冰箱冷凍待測。利用131I皮質醇放射免疫試劑盒測定血漿皮質醇濃度，根據(jù)公式：C皮質酮=50×C皮質醇，得到本次研究所需皮質酮質量濃度[7]。當模型組大鼠受到應激刺激時，模型組較對照組血漿皮質酮濃度升高（P＜0.05），即模型建立成功。（2）仔鼠樣本收集：雌鼠分娩后，仔鼠在出生后21 d斷乳，每組均隨機抽取16只記為對照仔鼠組（16只，雌雄各半）和模型仔鼠組（16只，雌雄各半），并于當天收集兩組仔鼠新鮮糞便至無菌凍存管中，并迅速存放于-80℃冰箱中待測。（3）腸道菌群測序及分析：兩組均隨機抽取6個糞便樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16S rRNA的測序。采用PCR擴增技術，擴增引物見表1，擴增長度為468 bp。利用Miseq PE300平臺進行測序，測定大鼠糞便中微生物16S rRNA V3、V4區(qū)序列，使用美吉生物云平臺比較分析雌鼠及子代糞便樣品中微生物群落結構、組成和差異。α多樣性用來反映屬水平腸道菌群的多樣性，其中Chao、Sobs指數(shù)用來表示物種豐度，Simpson指數(shù)用來表示物種多樣性，Coverage用來表示菌群覆蓋度；Venn圖反映屬水平腸道菌群組成相似性及重疊情況；基于樣本群落數(shù)據(jù)采用組間差異顯著性檢驗觀察對照仔鼠組與模型仔鼠組之間物種組成的差異。（4）靶向代謝物測定及關聯(lián)性分析：精確稱取100 mg糞便樣本于2 mL研磨管中，加入研磨珠和1 mL研磨液（含0.5%磷酸和50μg·mL-1內標2-乙基丁酸），于冷凍研磨儀50 Hz研磨3 min，研磨2次；冰水浴超聲30 min；4℃靜置30 min；4℃13 000×g離心15 min；取全部上清液到新的1.5 mL離心管中；加入500μL乙酸乙酯于上清溶液中進行萃取，渦旋混勻，冰水浴超聲10 min，4℃13 000×g離心10 min，取上清溶液，利用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS）進行上機分析。采用MassHunter定量軟件（美國安捷倫公司）默認參數(shù)對目標短鏈脂肪酸各離子碎片進行自動識別和積分，并輔助人工檢查。根據(jù)計算公式：樣品短鏈脂肪酸含量（μm·mg-1）=（C×V）/M，并結合標準曲線計算各個樣品的檢測濃度，換算出樣品中短鏈脂肪酸的實際含量。

表1 PCR擴增引物

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，對照組與模型組的血漿皮質酮含量采用重復測量方差分析，通過兩獨立樣本t檢驗比較對照仔鼠組和模型仔鼠組腸道菌群的α指數(shù)多樣性；采用單因素方差分析比較子代兩組間短鏈脂肪酸代謝差異；采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）和相關性Heatmap圖來反映短鏈脂肪酸與腸道菌群之間的關聯(lián)性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 孕期應激對母代血漿皮質酮含量的影響

對母代對照組與模型組的血漿皮質酮含量進行重復測量的方差分析，結果顯示兩組之間血漿皮質酮濃度差異具有統(tǒng)計學意義（F=7.717，P=0.024）。模型組在應激第7天、14天的血漿皮質酮質量濃度高于同時點的對照組（t=2.341、5.414，P均＜0.05），見表2。

表2 孕期應激對母代血漿皮質酮含量的影響（±s，ng·mL-1）

表2 孕期應激對母代血漿皮質酮含量的影響（±s，ng·mL-1）

與同時點對照組比較*P＜0.05。

組別 n 應激前1 d 應激后第1天 第7天 第14天 第21天對照組 8 80.44±22.59 95.91±42.74 95.04±14.58 105.48±14.10 96.12±16.92模型組 8 81.14±27.78 92.41±16.47 132.26±16.47* 161.46±18.32* 128.53±42.86

2.2 孕期應激對子代腸道菌群構成的影響

2.2.1 子代屬水平腸道菌群α多樣性分析 對照仔鼠組的Chao、Sobs、Simpson指數(shù)均高于模型仔鼠組（P均＜0.05），提示孕期應激降低了仔鼠物種豐度和物種多樣性；Coverage指數(shù)方面，兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示兩組仔鼠屬水平菌群覆蓋度無明顯差異，見圖1。

圖1 孕期應激仔鼠腸道菌群α多樣性分析

2.2.2 子代屬水平腸道菌群的物種組成（1）物種組成分析。根據(jù)Venn圖，對照仔鼠組屬水平腸道菌群物種數(shù)138種，模型仔鼠組131種，其中兩組共有物種數(shù)126種，對照仔鼠組獨有的物種數(shù)為12種，模型仔鼠組5種，模型仔鼠組物種數(shù)目少于對照仔鼠組，見圖2。（2）群落組成分析。兩組屬水平腸道菌群構成差異圖顯示，模型仔鼠組乳酸菌屬（Lactobacillus）相對豐度為30.89%，低于對照仔鼠組的35.41%；而模型仔鼠組的norank_f_穆氏桿菌屬相對豐度為21.46%，高于對照仔鼠組的19.48%，見圖3。

圖2 孕期應激子代屬水平腸道菌群物種數(shù)目及分布Venn圖

圖3 子代屬水平腸道菌群組間構成差異圖

2.3 孕期應激對子代短鏈脂肪酸代謝的影響

模型仔鼠組的糞便代謝物短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸的含量均高于對照仔鼠組（P均＜0.05），見表3。

表3 子代組間短鏈脂肪酸濃度比較（x±s，μm·mg-1）

2.4 子代腸道菌群與短鏈脂肪酸含量的相關性

通過RDA解釋子代屬水平短鏈脂肪酸與腸道菌群的關系，結果顯示，對照組仔鼠組與模型仔鼠組的群落之間有差異，戊酸、異戊酸對腸道菌群的影響相差不大，相比之下，乙酸、丙酸和丁酸對腸道菌群的影響較大。各個短鏈脂肪酸之間都成銳角提示均呈正相關。通過各樣本到箭頭的投影點距離看出，不同短鏈脂肪酸對相同組別不同樣本群落分布的影響差別不大。坐標軸中第一排序軸能（RDA1）為84.54%、第二排序軸能（RDA2）為6.23%，表示橫、縱軸對腸道菌群變化的解釋比例分別為84.54%和6.32%，見圖4A。

采用Heatmap圖來表示物種豐度前20的腸道菌群與短鏈脂肪酸之間的相關性，結果顯示，Phascolarctobacterium與丁酸呈負相關（r=-0.82，P＜0.05），與異戊酸呈負相關（r=-0.82，P＜0.05）；梭菌屬_sensu_stricto_1與丙酸呈正相關（r=0.94，P＜0.01），與丁酸呈正相關（r=0.94，P＜0.01），與異戊酸呈正相關（r=0.94，P＜0.01）；普雷沃氏菌屬_NK3B31_group與乙酸呈正相關（r=0.81，P＜0.05），與戊酸呈正相關（r=0.81，P＜0.05），與丁酸呈正相關（r=0.81，P＜0.05），與異戊酸呈正相關（r=0.81，P＜0.05）；雙歧桿菌（Bifidobacterium）與丙酸呈正相關（r=0.83，P＜0.05），見圖4B。

圖4 子代腸道菌群與短鏈脂肪酸含量的相關性

3 討論

皮質酮是母體孕期應激影響胎兒發(fā)育的主要介質，當母體受到應激時，皮質酮濃度升高[8]。本研究結果顯示，模型組大鼠第7天、14天測得的血漿皮質酮濃度均高于對照組，表明模型組大鼠處于應激狀態(tài)，第21天模型組的血漿皮質酮濃度有所下降，可能與孕中、后期下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）對應激的適應有關[9]。研究[10]表明，慢性應激開始時，血漿皮質酮水平升高，一段時間后有所降低，與本研究結果相似。

腸道菌群是定植于人體腸道的微生物群落，分為益生菌、致病菌和條件致病菌三類[11]。腸道中菌群分布正常時對維持機體穩(wěn)態(tài)是有益的，一旦菌群失衡，可能會引起機體慢性病的發(fā)生[12]。研究[13]表明，孕期應激會改變母代的腸道菌群結構，分娩時羊水中的菌群會定植在嬰兒腸道，從而引起子代腸道菌群的改變。本研究通過α多樣性分析顯示，對照仔鼠組腸道菌群的物種多樣性較模型仔鼠組高，模型仔鼠組屬水平物種數(shù)目要低于對照仔鼠組，物種組成也各不相同，以上均提示孕期CUMS對子代腸道菌群的構成有影響，與王立鵬[14]的研究結果一致。對子代屬水平腸道菌群的進一步差異分析顯示，模型仔鼠組的乳酸菌屬水平下調，而普雷沃氏菌屬_NK3B31_group和Akkermansia的水平上調，與馮彥等[15]的研究結果一致。本研究結果顯示，普雷沃氏菌屬_NK3B31_group與乙酸、異戊酸呈正相關，普雷沃氏菌屬的主要發(fā)酵物為乙酸、異戊酸等[16]，能夠解釋這一現(xiàn)象，同時也與模型仔鼠組乙酸、異戊酸代謝量升高的結果一致。

短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物，能夠反映宿主與腸道菌群之間的聯(lián)系[17]。本研究顯示，模型仔鼠組的乙酸、丙酸和丁酸的代謝量均增高。產(chǎn)生短鏈脂肪酸的腸道菌群主要是擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬和鏈球菌屬[18]。腸道菌群差異分析顯示，模型仔鼠組的雙歧桿菌屬物種豐度高于對照仔鼠組，這可能是導致模型組子代短鏈脂肪酸代謝量升高的原因。有報道[19]表明，多種環(huán)境因子中短鏈脂肪酸對腸道菌群多樣性的影響最大，本研究結果顯示，梭菌屬_sensu_stricto_1與短鏈脂肪酸的關聯(lián)性較強，且均呈正相關，其中乙酸和丁酸與其關聯(lián)性最強。有研究[20]表明，丁酸主要由梭菌屬產(chǎn)生，乙酸有利于產(chǎn)生丁酸的菌群的生長，以上表明腸道菌群與短鏈脂肪酸有一定的相關性。

綜上所述，孕期CUMS會使母鼠的血漿皮質酮含量升高，使其處于應激狀態(tài)，對子代腸道菌群的物種組成及物種多樣性產(chǎn)生影響，從而改變短鏈脂肪酸的代謝水平。短鏈脂肪酸作為腸道菌群的代謝產(chǎn)物與腸道菌群存在關聯(lián)性。