姚霞珍，桑利群，徐 慧，李 雙，陳麗仙

（西藏農(nóng)牧學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，西藏 林芝 860000）

大花黃牡丹（Paeonia ludlowii）屬毛茛科芍藥屬落葉灌木，是西藏特有瀕危植物［1］，生于海拔2 900～3 200 m 的雅魯藏布江河谷及山坡林緣。其植株高大，黃色花朵碩大，是珍貴的觀賞、育種材料，屬于國家二級保護(hù)植物，喜溫和氣候、較耐寒，抗旱能力較弱［2，3］。大花黃牡丹自然繁殖方法為種子繁殖［4-6］，存在繁殖速度慢、苗木品質(zhì)弱、種苗數(shù)量缺乏等問題，大花黃牡丹的快速繁殖成為急需解決的問題。利用組培快速繁殖的方法培育優(yōu)良品種苗，可以不受地區(qū)、氣候的影響，且增殖速度比常規(guī)方法更快［7］，能夠高效、快速地獲得大花黃牡丹種苗，加速大花黃牡丹優(yōu)良品種的繁育。該研究分析了基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 對大花黃牡丹不定芽誘導(dǎo)增殖的影響，以期為今后的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

外植體的選擇是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，外植體選擇合適與否直接影響消毒、無菌體系建立以及整個組培流程的難易程度［7，8］。采集時間為2020年9月下旬、2021年3月中旬，采集地點(diǎn)為西藏自治區(qū)林芝市西藏珍稀瀕危園林植物培育基地，在晴天午間選取健壯、無病蟲害的高約1～2 m 的大花黃牡丹母株，切取其飽滿、未萌發(fā)的腋芽及頂芽。

1.2 啟動培養(yǎng)

1.2.1 啟動培養(yǎng)基 培養(yǎng)基作為植物組織培養(yǎng)的重要材料和營養(yǎng)來源，其組成成分直接影響外植體的脫分化與再分化狀態(tài)，是起決定性作用的因素［7，8］。本次試驗(yàn)選用2 種培養(yǎng)基進(jìn)行對比分析。

培養(yǎng)基1：WPM+0.5 mg/L 6-BA+30.2 mg/L GA+30.0 g/L 蔗糖+7.5 g/L 瓊脂，pH 為5.8～6.0。

培養(yǎng)基2：WPM（含20.0 g/L 蔗糖+8.0 g/L 瓊脂）+0.5 mg/L 6-BA+30.2 mg/L GA，pH 為5.8～6.0。

將培養(yǎng)基置于滅菌鍋，120 ℃滅菌20 min，然后轉(zhuǎn)至超凈工作臺等待外植體接種。

1.2.2 外植體清洗及消毒 挑選健壯飽滿大花黃牡丹的頂芽和腋芽，剝除外部2～3層鱗片，將剝好的芽于自來水下沖洗30 min，洗滌劑浸泡8～10 min，流水沖洗30 min。將清洗干凈的芽轉(zhuǎn)到超凈工作臺，用75%的乙醇浸泡滅菌20～30 s，再用2%的次氯酸鈉浸泡滅菌7 min，重復(fù)2次，最后，無菌去離子水沖洗4～5遍［9］。

1.2.3 啟動培養(yǎng)接種 將剩余芽體接種于啟動培養(yǎng)基，每瓶接種1 個外植體，每組接種15 瓶，重復(fù)3 次，培養(yǎng)35～40 d。

1.3 增殖培養(yǎng)

在啟動培養(yǎng)優(yōu)選出的培養(yǎng)基中分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 的6-BA，篩選適宜大花黃牡丹繼代苗增殖的最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度。

在無菌條件下取初代芽，分別接入不同的培養(yǎng)基中，每組處理20 瓶，重復(fù)3 次。接種后每隔10 d 觀察生長情況，第35 d 時取出，在無菌條件下統(tǒng)計株高、葉片數(shù)及增殖率。

1.4 培養(yǎng)條件

在組織培養(yǎng)過程中，光照、溫度、培養(yǎng)基pH 是誘導(dǎo)木本植物器官發(fā)生的重要因素［7，8］。光照對組織褐變、試管苗成熟以及玻璃化均有顯著影響，溫度與酚類化合物合成以及組培苗生根有關(guān)［10，11］。該試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照度32.4 mol/（m2·s），光周期為14 h 光照、10 h 黑暗，培養(yǎng)基pH 為5.8～6.0，以上所有試驗(yàn)均在西藏農(nóng)牧學(xué)院第二實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，SPSS Statistics 26 軟件方差分析，鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

不定芽增殖率=（再生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)選培養(yǎng)基

在啟動培養(yǎng)試驗(yàn)中觀察得出的數(shù)據(jù)中，WPM+30.0 g/L 蔗糖+7.5 g/L 瓊脂+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA 更有利于不定芽生長。

在啟動培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將產(chǎn)生的不定芽接種到不定芽增殖分化培養(yǎng)基上，10 d 后可以觀察到基部有不定芽產(chǎn)生，17 d 后單芽基部產(chǎn)生的不定芽生長明顯。

2.2 不同濃度6-BA 對大花黃牡丹試管苗生長的影響

2.2.1 對試管苗株高的影響 不同濃度6-BA 對試管苗株高的影響見圖1，5 個6-BA 處理組的株高均顯著高于對照（CK），在6 個組中，6-BA 為0.5 mg/L時，試管苗平均株高最高，顯著高于其他處理組合；CK 組的試管苗平均株高最低。因此，添加濃度為0.5 mg/L 6-BA 時最有利于試管苗長高。

圖1 不同濃度6-BA 對試管苗平均株高的影響

2.2.2 對試管苗葉片平均數(shù)的影響 不同濃度6-BA 對試管苗葉片平均數(shù)的影響見圖2，在6 個處理組中，6-BA 為0.5 mg/L 時，試管苗葉片平均數(shù)最多，顯著多于其他處理組合；CK 組的試管苗葉片平均數(shù)最低。因此，6-BA 濃度為0.5 mg/L 時最有利于試管苗葉片的生長，其他濃度的6-BA 相對較弱，CK 組表現(xiàn)效果最弱。

圖2 不同濃度6-BA 對試管苗葉片平均數(shù)的影響

2.2.3 對試管苗增殖率的影響 不同濃度6-BA 對試管苗增殖率的影響見圖3，5 個6-BA 處理組培苗苗增殖率均顯著高于CK 組，在6 個處理組中，6-BA濃度為0.5 mg/L 時試管苗增殖率最高，顯著高于其他處理組合；CK 組的試管苗增殖率最低。因此，6-BA 濃度為0.5 mg/L 時最有利于試管苗的增殖，而CK 組對試管苗增殖的影響最小。

圖3 不同濃度6-BA 對試管苗增殖率的影響

2.2.4 對試管苗生長質(zhì)量的影響 從表1、圖4 可知，6-BA 濃度為0.4、0.5 mg/L 時，大花黃牡丹試管苗芽的質(zhì)量等級最高，但因D 處理的玻璃化等級高于E 處理，因此，6-BA 為0.5 mg/L 時最適宜試管苗的生長；而CK 組和A 處理的芽質(zhì)量等級均最低，但因CK組的玻璃化等級高于A 處理，所以未添加6-BA 的培養(yǎng)基最不利于試管苗的生長。

圖4 不同濃度6-BA 中試管苗增殖和生長的狀況

表1 不同濃度6-BA 對試管苗增殖和生長的影響

3 小結(jié)與討論

從大花黃牡丹不定芽的增殖和生長狀況來看，添加了植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA 的培養(yǎng)基明顯更有利于組培苗的生長。雖然培養(yǎng)基的成分和植物生長調(diào)節(jié)劑的種類等都會對不定芽的獲取產(chǎn)生一定的影響，但起決定作用的主要是植物生長調(diào)節(jié)劑［9］。細(xì)胞分裂素的主要作用是促進(jìn)植物細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，從而使愈傷組織分化形成不定芽，所以適量的細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)組織分化，提高芽增殖倍數(shù)［12，13］。

在組織培養(yǎng)中通常使用人工合成的性能穩(wěn)定且價格適中的KT 和6-BA，而在許多木本花卉及熱帶觀葉花卉的組培生產(chǎn)中，使用6-BA 均較KT 效果更好［12-14］，所以本試驗(yàn)選擇了6-BA 作為促進(jìn)植物細(xì)胞分裂與擴(kuò)大以及誘導(dǎo)愈傷組織形成不定芽的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，并通過單因素濃度梯度對比獲取適宜大花黃牡丹不定芽增殖的生長調(diào)節(jié)劑濃度，為今后多因素對比試驗(yàn)提供一定的參考。