劉曼莉，舒 芬，張亞妮，方 偉，石麗橋，王開梅，吳兆圓

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

隨著自然環(huán)境和人類社會的變化，新型傳染病不斷出現(xiàn)，包括細菌、病毒或其他，都對人類健康及家畜養(yǎng)殖帶來了極大的危害。目前的藥物遠不能滿足需求，新出現(xiàn)的疾病如新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠）和非洲豬瘟等仍不能完全控制，已消除的疾病又重新出現(xiàn)如天花等，還有反復(fù)變異的流感病毒等導(dǎo)致的疾病的存在，都對人類的生活及食品安全有著重要的影響。細菌的耐藥性及病毒變異也是藥物研究的重點，新藥研發(fā)顯得日益重要，雖然疫苗等生物制劑是很好地控制疾病的手段，但是化學(xué)藥品在治療過程中也有著非常突出的優(yōu)勢。

天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)中先導(dǎo)化合物的重要來源之一。據(jù)研究已上市的藥物中，天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的衍生物占比將近50%［1］。天然產(chǎn)物來源豐富，包括動物、植物和微生物等體內(nèi)分離獲得的次生代謝產(chǎn)物及內(nèi)源性活性化合物，如來源于細菌代謝物的青霉素和鏈霉素，其自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)在對抗細菌感染中應(yīng)用了幾十年，仍然是抗感染的首選藥。來源于植物的青蒿素不僅在對抗瘧疾中有很好的效果，近年來還發(fā)現(xiàn)在抗血吸蟲、抗菌、抗腫瘤和抗炎等方面也有重要作用［2-4］；紫杉醇作為一種天然抗癌藥物在臨床上已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和肺癌等的治療［5，6］。天然產(chǎn)物雖然結(jié)構(gòu)復(fù)雜，合成難度大，但其結(jié)構(gòu)多樣，容易發(fā)現(xiàn)新結(jié)構(gòu)、新活性的化合物。

本研究從1 株真菌SF-49356 的代謝物中發(fā)現(xiàn)一系列具有相似結(jié)構(gòu)的化合物，對該類化合物進行分離、提取和鑒定，并對其抗菌、抗病毒活性進行篩選，以期能為將來研發(fā)抗感染類藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、病毒和細胞 SF-49356 菌株分離自武漢市周邊土壤樣本，現(xiàn)保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心。大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、沙門氏菌（Salmonella，ATCC 14028）、金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus，ATCC 25923）、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SC19）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）、Vero 細胞和Marc-145 細胞均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。大腸桿菌和沙門氏菌使用LB 培養(yǎng)基，由酵母粉、胰蛋白胨和氯化鈉按配方配制，固體培養(yǎng)基在LB 培養(yǎng)基中加入瓊脂粉。酵母粉和胰蛋白胨購自O(shè)XOID 公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、氯化鈉和瓊脂粉均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌使用含10%小牛血清的TSB（胰酪大豆胨液體）和TSA（胰酪大豆胨瓊脂）培養(yǎng)基。TSB 和TSA 培養(yǎng)基均購自BD Difco公司，按配方配制；小牛血清購自杭州四季青生物有限公司。

頭孢匹羅（Cefpirome sulfate，S25863，98%）購自上海源葉生物科技有限公司。青霉素（Ampicillin，T0814L，99.27%）和鏈霉素（Streptomycin sulfate，0060，720IU）購自上海陶素生化科技有限公司。青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅用無菌水溶解，化合物的儲存濃度均為10 mg/mL，試驗時使用細菌培養(yǎng)基LB或TSB 稀釋成相應(yīng)的使用濃度，同時設(shè)立DMSO（二甲基亞砜）和無菌水的陰性對照孔。

噻唑藍（MTT，0793，＞98%）購自Amresco 公司。

綿羊紅細胞購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Waters 2695 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）；Water 2767 高效液相制備儀（Waters 2525 泵，帶2767 自動收集系統(tǒng)；2996 二級管陣列檢測器；色譜工作站Masslynx V4.0）；美國Sunfire C18 OBD 制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛爾蘭）。分離提取所用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)和提取 將菌株SF-49356 的種子置于PDA 培養(yǎng)基中，于28 ℃在平皿中靜置培養(yǎng)，發(fā)酵7 d 后，在無菌條件下將種子接入100 mL 酵母培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d 得發(fā)酵液。發(fā)酵液中加入20 L 乙酸乙酯攪拌提取3 次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物。

1.2.2 活性跟蹤和分離純化 提取物溶解于甲醇中，用反相制備色譜柱（Sunfire C18OBD 制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，27 mL/min）進行粗分，洗脫梯度為40%～100%乙腈，洗脫40 min，然后再針對活性化合物進行細分，采用洗脫梯度5%～100%得到 化 合物SF-49356-1、SF-49356-2、SF-49356-3、SF-49356-4、SF-49356-5、SF-49356-6、SF-49356-7和SF-49356-8。

1.2.3 藥物最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會（CLSI，2012年）推薦的微量肉湯稀釋法，將純化的細菌劃線接種于LB 或TSA 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于LB或TSB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)12 h。將菌液按1∶1 000 的比例接種于LB 或TSB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.5（菌量約為1×108CFU/mL），再將菌懸液1∶500 稀釋后備用。在96 孔培養(yǎng)板中每孔加入50 μL 倍比稀釋的不同濃度的藥物，加入50 μL 稀釋的菌液，每種藥物每株菌進行3 次重復(fù)，同時設(shè)陰性對照和陽性對照。對照藥物選擇青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅。置于37 ℃溫箱中孵育16～20 h，讀取結(jié)果。肉眼觀察微量稀釋孔中以無細菌生長現(xiàn)象的最高藥物稀釋濃度為該藥物對該種細菌的藥物最小抑菌濃度。平行操作3 次，以3 次結(jié)果的平均值作為此藥對該細菌的MIC。

1.2.4 藥物對細胞的毒性作用 于長滿單層的細胞中加入不同濃度的藥物，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，同時設(shè)置不加藥物的細胞對照。用MTT 法檢測細胞的存活率，96 孔板內(nèi)長滿單層的細胞，用PBS（磷酸緩沖液）洗1～2 次，棄掉上清液，加入100 μL 的MTT，于37 ℃作用4 h，棄掉上清液，用PBS 洗1～2 次，加入DMSO 50 μL，室溫避光10 min，振蕩混勻后于酶標(biāo)儀中檢測OD492nm。細胞存活率=（樣品OD492nm/細胞對照OD492nm）×100%，通過SPSS 16.0 軟件計算藥物的半數(shù)細胞毒性濃度（CC50）。

1.2.5 藥物抑制病毒感染的作用 于長滿單層的細胞中加入稀釋好的病毒液（100TCID50）和不同濃度的藥物，于37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，同時設(shè)置只加病毒的病毒對照及不加病毒和藥物的細胞對照。用MTT 法檢測細胞的存活率，細胞存活率=［（樣品OD492nm－病毒對照OD492nm）/（樣品OD492nm－細胞對照OD492nm）］×100%，通過SPSS 16.0軟件計算藥物對病毒的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.6 溶血試驗 將綿羊紅細胞1 000 r/min 離心5 min，用PBS 洗2 次，并用PBS 稀釋成2%溶液備用?；衔镆灿肞BS 進行倍比稀釋，1∶1 加入紅細胞，同時分別設(shè)置不加藥的細胞對照和加入1% Triton X-100 的陽性對照，于37 ℃作用2 h，1 000 r/min 離心10 min。將150 μL 上清液移動到新的96 孔板中，用酶標(biāo)儀測定OD540nm。樣品的溶血百分比=［（樣品OD540nm-陰性對照OD540nm）（陽性對照OD540nm-陰性對照OD540nm）］×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)LC-MS 分析結(jié)果及天然產(chǎn)物詞典（DNP）查詢結(jié)果，推斷化合物SF-49356-1（化合物1）至SF-49356-8（化合物2）為恩鐮孢菌素類（Enniatins）化合物，進一步根據(jù)每個化合物的分子質(zhì)量及其核磁共振碳譜（C13-NMR 譜），并結(jié)合文獻［7-10］將其推斷為Enniatin B、Enniatin B1、Enniatin D、Enniatin G、Enniatin E、Enniatin A1、Enniatin F 和Enniatin A，結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量見圖1 和表1。

圖1 Enniatin 結(jié)構(gòu)

表1 化合物結(jié)構(gòu)

2.2 化合物抗菌MIC 測定

將8 個化合物分別與4 株細菌大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌共同培養(yǎng)，將樣品從100.000 μg/mL 到0.781 μg/mL 進行倍比稀釋，同時以青霉素、鏈霉素和頭孢匹羅作為陽性對照，結(jié)果見表2?；衔? 和化合物8 對豬鏈球菌有一定的抗菌活性，MIC分別為25.00 μg/mL 和50.00 μg/mL?；衔?、化合物3 和化合物6 對金黃色葡萄球菌的MIC均為100.00 μg/mL。8 個化合物對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門氏菌均無明顯的抗菌活性。

表2 化合物抗菌MIC 結(jié)果 （單位：μg/mL）

2.3 藥物對細胞的毒性作用結(jié)果

將8 個化合物稀釋后分別加入Vero 和Marc-145 細胞，共同培養(yǎng)48 h，用MTT 法檢測細胞的存活率，并計算化合物的CC50，結(jié)果見表3?；衔? 在2個細胞中的CC50為13.331～24.959 μg/mL。其他7 個化合物的CC50在Vero 和Marc-145 細胞中為0.380～3.111 μg/mL。

表3 化合物半數(shù)細胞毒性CC50結(jié)果（單位：μg/mL）

2.4 藥物對PRV 和PRRSV 的活性研究

根據(jù)化合物的CC50，將化合物進行倍比稀釋，與100 TCID50的PRV 病毒加入Vero 細胞共同培養(yǎng)48 h；或與100TCID50的PRRSV 病毒加入Marc-145細胞中共同培養(yǎng)72 h，至病毒對照出現(xiàn)病變，用MTT法檢測細胞的存活率。結(jié)果表明，8 個化合物對2 個病毒均未表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。

2.5 藥物對紅細胞的毒性作用

將化合物進行倍比稀釋，加入同體積的2%紅細胞，使終濃度為20.000～0.625 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)2 h，同時設(shè)置不加藥的細胞對照和加TritonX-100的陽性對照孔，將溶血百分比為50%以上視為溶血。結(jié)果（表4）表明，化合物1、化合物4、化合物5和化合物7 在20 μg/mL 內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有溶血現(xiàn)象，化合物2 和化合物3 在20 μg/mL 時有溶血，化合物6 和化合物8 在5 μg/mL 時有溶血。表明該類化合物對紅細胞有一定的毒性作用且具有劑量依賴性。

表4 最低溶血濃度

3 討論

恩鐮孢菌素（Enniatin，ENNs）主要是由鐮刀菌屬的菌種侵染小麥、大麥、黑麥和燕麥等谷物后，在潮濕和低溫條件下產(chǎn)生的真菌毒素［7，11，12］。其中，恩鐮孢菌素A（Enniatin A，ENA）、恩鐮孢菌素A1（Enniatin A1，ENA1）、恩鐮孢菌素B（Enniatin B，ENB）和恩鐮孢菌素B1（Enniatin B1，ENB1）［13-16］在食品中較常見。研究發(fā)現(xiàn)Enniatins 具有基因毒性和細胞毒性，可誘導(dǎo)染色體畸變、姊妹染色單體交換和微核形成等［17-19］。因此，在食品安全研究中常作為真菌毒素進行檢測。但隨著對該類化合物的深入研究發(fā)現(xiàn)，Enniatins 作為離子載體，能形成一價陽離子的“Sandwich”絡(luò)合物，穿過細胞膜，并對膜電位產(chǎn)生影響［20，21］。Enniatin 類化合物具有抗菌、殺蟲和抗HIV活性［22-24］。也有報道化合物Enniatins A1、Enniatins B 和Enniatins B1 能夠產(chǎn)生抗癌活性［25］。Enniatin B可以協(xié)同抗真菌藥物對白色念球菌的生物膜有殺滅作用［26］。Enniatin 類化合物還是膽甾醇乙?；D(zhuǎn)移酶（ACAT）抑制劑，在體內(nèi)可減少甘油三酸酯合成［27］。近年來還發(fā)現(xiàn)這類化合物能夠抑制ATP 能量依賴型的多藥物載體（ABC transporters），特別是對多效耐藥調(diào)控蛋白5（Pdr5p）有高抑制活性［28］。本研究結(jié)果也顯示，Enniatin 類化合物對革蘭氏陽性菌有一定的抗菌活性，這些研究充分說明Enniatin 類化合物在抗感染、抗癌等方面有很好的應(yīng)用前景。

本研究從1 株真菌的代謝產(chǎn)物中分離獲得了8個化合物，經(jīng)紫外、質(zhì)譜、C13-NMR 譜以及DNP 查詢，并結(jié)合文獻數(shù)據(jù)［7-10］，確定化合物為恩鐮孢菌素類化合物。對該類抗菌和抗病毒活性進行初步篩選，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌包括金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌具有一定的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和沙門氏菌無作用。其中，5 個化合物的抗病毒活性篩選研究并未發(fā)現(xiàn)明顯的抗病毒活性，且有3 個化合物在高劑量時對紅細胞具有溶血活性，化合物對細胞有一定的毒性?？紤]該類化合物主要具抗菌活性，具體的作用機制還需要更多的試驗數(shù)據(jù)支持。因此，本研究對Enniatins 的抗菌、抗病毒及細胞毒性進行的探究，可為將來新型藥物的研制提供理論依據(jù)。