宋張楊，韋 昊，魏 玥，孫曉懿，孫照東，焦瑞峰

（黃河水資源保護(hù)科學(xué)研究院，河南鄭州 450004）

工業(yè)廢水污染物種類繁多且成分復(fù)雜，不可避免存在無法處理或未降解完全的有毒成分，威脅環(huán)境和公共健康以及對污水處理廠的活性污泥體系造成致命沖擊〔1-2〕。常規(guī)監(jiān)測指標(biāo)測定污水中的無機(jī)污染物和有機(jī)污染物指標(biāo)，不能反映污水排入水體后的綜合毒性效應(yīng)，而生物毒性測試可以更直接表征污水的安全性〔3〕。2015 年11 月環(huán)境保護(hù)部辦公廳修訂的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（征求意見稿）中也將綜合毒性（稀釋倍數(shù)）列入城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)的選擇控制項目。

發(fā)光細(xì)菌法是基于一種海洋發(fā)光細(xì)菌費氏弧菌Vibrio fischeri的發(fā)光活性，利用靈敏的光電檢測系統(tǒng)測定廢污水中的毒性物質(zhì)對發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響，判斷毒性物質(zhì)的毒性大小。因其監(jiān)測步驟簡單，獲得結(jié)果快速而在污水、土壤、污泥、垃圾滲濾液、海洋水產(chǎn)品等綜合毒性評價中廣泛應(yīng)用〔4-8〕。

本試驗以某煤化工企業(yè)污水處理廠進(jìn)出水為研究對象，采用發(fā)光細(xì)菌法對其進(jìn)水和出水進(jìn)行毒性測定，為化工企業(yè)污水處理廠污水達(dá)標(biāo)排放提供合理的評價和預(yù)警依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品和試驗條件

試驗樣品取自某煤化工企業(yè)污水處理廠的進(jìn)水口和出水口。測試細(xì)菌：海洋發(fā)光細(xì)菌費氏弧菌（Vibrio fischeri）。所有試驗操作按照ISO 11348—32007 年第二版《水質(zhì)—水樣對費式弧菌發(fā)光抑制影響的測定第3 部分：使用凍干細(xì)菌法》所規(guī)定的試驗條件和試驗方法進(jìn)行〔9〕。

1.2 樣品采集

用棕色樣品收集瓶采集樣品。采集水樣后瓶內(nèi)應(yīng)充滿水樣，不留空氣，并用封口膜密封好，瓶外用鋁箔紙包好，避光保存。毒性測定應(yīng)在采樣后6 h 內(nèi)進(jìn)行，否則需要2～5 ℃下避光保存待測樣品，不超過48 h。

1.3 樣品預(yù)處理

對于有固體懸浮物的樣品，須靜置0.5～1 h 或離心或過濾去除，以免干擾測定。

調(diào)節(jié)pH（手持pH 計測定），所有的樣品需要測量pH，樣品pH 需要處于6.0～8.5 之間。如需調(diào)節(jié)pH，使用鹽酸或氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。鹽酸或氫氧化鈉溶液的加入量不能超過總體積的5%（必要時可使用高濃度的溶液來減少加入體積）。

調(diào)節(jié)鹽分（電導(dǎo)率儀測定），根據(jù)所測鹽分值添加NaCl到樣品中，使樣品的含鹽質(zhì)量濃度達(dá)到20 g∕L NaCl 等值滲透性。對于含鹽量低的樣品，直接添加NaCl 將其滲透性達(dá)到20 g∕L NaCl。如樣品中含有20～50 g∕L NaCl 等值物，則不需要加入鹽，但最終含鹽量不能超過20 g∕L NaCl 的滲透性。

1.4 試劑和儀器設(shè)備

費式弧菌（Vibrio fischeri）菌種凍干粉：購自中宜儀器水質(zhì)毒性篩查試劑盒（發(fā)光細(xì)菌）ZYI TOX-kitⅣ。儲存于-20 ℃。

樣品稀釋液：質(zhì)量濃度為20 g∕L 的NaCl 溶液，4 ℃保存。亦可作陰性質(zhì)控液。

陽性參照液：試劑盒配備的ZnSO4溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg∕L，Zn2+質(zhì)量濃度相當(dāng)于227.36 mg∕L，細(xì)菌50%發(fā)光抑制的Zn2+質(zhì)量濃度為2.0 mg∕L。測試中陽性質(zhì)控液的配制為4.4 μL ZnSO4母液加入495.6 μL 樣品稀釋液混勻。

其他設(shè)備：冰箱，用于儲藏菌種和試劑；金屬浴溫度調(diào)節(jié)模塊（M500），維持測試樣品在（15±1）℃；Microtox Model 500 毒性測定儀；試管（圓形比色皿），生物發(fā)光檢測儀配套的試管，與金屬浴溫度調(diào)節(jié)模塊相適合；pH計；計時器；移液器，10μL、100 μL、1 000 μL、5 mL；移液器配套的槍頭；試管架；容量瓶；棕色樣品收集瓶。

1.5 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測定實驗

費式弧菌（Vibrio fischeri）急性毒性測定實驗按照以下步驟進(jìn)行。

儲備菌體懸浮液的制備：提前在4 ℃冷卻1 mL 菌體復(fù)活液（來自試劑盒附帶）。從-20 ℃取出細(xì)菌凍干粉，將提前預(yù)冷的1 mL 菌體復(fù)活液迅速倒入凍干細(xì)菌，輕輕晃動細(xì)菌凍干粉使其快速溶解。復(fù)蘇的發(fā)光細(xì)菌懸浮液作為儲備懸浮液用于檢測，儲存在4 ℃。

測試懸浮液的制備（參照Deltatox?user’s manual〔10〕中45% B-TOX 毒性測試方法）：待儲備菌體懸浮液混合均勻（10 min 以上），吸取10 μL 儲備懸浮液，500 μL 的細(xì)菌復(fù)蘇液和滲透壓調(diào)節(jié)液中，然后放入15 ℃的金屬浴溫度調(diào)節(jié)模塊中，平衡5 min 以上，用于后續(xù)測定。大批次連續(xù)試驗時，可將儲備菌體懸浮液按照相同菌體濃度于100 mL 三角瓶中稀釋定容，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

測試溫度：測定溫度需要保持在（15±0.3）℃。所有的器皿和溶液測定前1 h 都需要保持在控溫測試室內(nèi)。

測試樣品稀釋系列：樣品的稀釋系列見表1，每個測試組別設(shè)2 個平行樣。

表1 樣品稀釋系列Table 1 Sample dilution series

檢測步驟：Microtox Model 500 毒性測定儀預(yù)熱15 min，開始測定經(jīng)過平衡的測試懸浮液的初始發(fā)光強(qiáng)度（I0），迅速加入1 000 μL 處理好的樣品和質(zhì)控液，搖勻測定完的試管繼續(xù)放回15 ℃的加熱模塊中保溫。分別測定反應(yīng)時間為15 min（I15）和30 min（I30）的樣品發(fā)光強(qiáng)度，記錄所有數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理和分析

以15 min 測試結(jié)果為例，30 min 的測試結(jié)果以相同方式表示。

陰性質(zhì)控組：I0為細(xì)菌的初始發(fā)光值，Ik15為細(xì)菌與稀釋液反應(yīng)15min后發(fā)光值，Ik15∕I0為校正系數(shù)，為校正系數(shù)的平均值，有效性檢驗為均值與Ik15∕I0的算術(shù)差除以均值來計算，平均偏差不超過3%，檢測有效。

陽性質(zhì)控組和樣品測試組：I0為細(xì)菌的初始發(fā)光值，I15為細(xì)菌與稀釋液反應(yīng)15 min 后發(fā)光值，為H15的均值。

EC20和EC50的計算：由已測定的樣品污水所占比 例ct和Γt值，根據(jù)公式lgct=b·lgΓt+lga〔9〕，可 得 出EC20和EC50，當(dāng)Γt=0.25 時對應(yīng)EC20時樣品污水所占比例，當(dāng)Γt=1.00 時對應(yīng)EC50時樣品污水所占比例。

2 結(jié)果與討論

表2 陰性質(zhì)控實驗（1～4 號）和陽性質(zhì)控實驗（5 號）結(jié)果Table 2 The results of negative control batch（No.1 to No.4）and positive control batch（No.5）

某煤化工企業(yè)污水處理廠進(jìn)水和出水的檢測結(jié)果見表3。

由表3 可知，1 號和2 號樣品在15 min 和30 min的測試結(jié)果趨于一致，菌群發(fā)光率損失較為穩(wěn)定，進(jìn)水毒性都較強(qiáng)，EC20-15分別為9.83% 和10.86%，EC50-15分別為19.20%和16.03%，EC20-30分 別 為7.76% 和10.86%，EC50-30分 別 為15.05% 和14.20%。1 號和2 號進(jìn)水樣品在經(jīng)過16 倍以上的稀釋后基本達(dá)到無毒。3 號和4 號出水樣品在4 倍稀釋后抑制率H15和H30均呈負(fù)值，即細(xì)菌發(fā)光量出現(xiàn)增長現(xiàn)象。

R.GUERRA〔11〕在 研 究工業(yè)廢水中 發(fā) 現(xiàn)COD 和Microtox?細(xì)菌毒性之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。而C.V.ARAúJO 等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)，工業(yè)污水進(jìn)水COD 和細(xì)菌毒性的實驗結(jié)果之間沒有明顯的相關(guān)性，而出水COD 和細(xì)菌毒性實驗結(jié)果有著很好的相關(guān)性。R.BOLUDA 等〔2〕在研究中發(fā)現(xiàn)，即樣品的成分越復(fù)雜，COD 與高毒性之間相關(guān)性越差。楊尚源等〔12〕在對市政污水處理廠廢水的生物抑制毒性測試中發(fā)現(xiàn)，廢水中含有較高濃度難降解的揮發(fā)性有機(jī)物（VOC）類物質(zhì)生物抑制毒性明顯。黃滿紅等〔13〕在對城市污水處理廠的毒性檢測中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制率與lnCODnb之間存在正相關(guān)，水樣中的難降解化學(xué)需氧量（CODnb）的比例可能是導(dǎo)致細(xì)菌毒性的原因之一。本研究中，該化工企業(yè)污水處理廠同批次樣品進(jìn)水COD 和BOD5的濃度值見表3。

表3 某煤化工企業(yè)污水處理廠進(jìn)水、出水毒性檢測和COD、BOD5檢測Table 3 The luminescent bacteria toxicity，COD，BOD5 test results of the inlet and outlet water of wastewater treatment plant of coal chemical enterprise

根據(jù)CODnb的計算公式〔13〕，CODnb=COD-BOD5∕0.58，計算得出1號進(jìn)水樣品的CODnb為101.28mg∕L，進(jìn)水CODnb∕COD為58.54%；2號進(jìn)水樣品的CODnb為135.31 mg∕L，進(jìn)水CODnb∕COD 為65.68%。3號出水樣品的CODnb為12.59 mg∕L，出水CODnb∕COD為15.73%；4 號出 水樣品的CODnb為12.66 mg∕L，出水CODnb∕COD 為15.25%。對比該批樣品的細(xì)菌毒性結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，廢污水的發(fā)光細(xì)菌抑制率與CODnb∕COD存在一定關(guān)系：1號和2號進(jìn)水樣品中CODnb所占進(jìn)水總的COD 的比例高時，細(xì)菌毒性實驗的發(fā)光抑制率也高，即毒性越強(qiáng)；廢污水的CODnb值低時，細(xì)菌毒性實驗的發(fā)光抑制率相應(yīng)低，甚至出現(xiàn)細(xì)菌發(fā)光量增長的現(xiàn)象。

廢污水中的污染物經(jīng)污水處理廠處理后達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)后，生物毒性有較大程度的消減，毒性檢測結(jié)果細(xì)菌發(fā)光的衰減量非常小，經(jīng)過校正系數(shù)計算后抑制率H15和H30均呈負(fù)值，即細(xì)菌發(fā)光量出現(xiàn)增長現(xiàn)象（見表3 中3、4 號批次樣品）。處理后的出水引起發(fā)光細(xì)菌發(fā)光量增加的現(xiàn)象，可能是出水中絕大部分污染物被降解，還存在某些營養(yǎng)物質(zhì)適合發(fā)光細(xì)菌生長。R.BOLUDA 等〔2〕曾報道，發(fā)光細(xì)菌法檢測農(nóng)田收集的灌溉排水的富營養(yǎng)化的水時并不敏感。細(xì)菌發(fā)光量增長也有可能是出水中的某種物質(zhì)引起的毒物興奮效應(yīng)（Hormesis）〔14-15〕。Kaili SHEN等〔15〕在研究中發(fā)現(xiàn)低濃度的Cu2+和Zn2+（低 于1 mg∕L）會明顯增加細(xì)菌的發(fā)光量，本研究認(rèn)為Cu2+和Zn2+本身就是細(xì)胞中一些酶活性的必須金屬離子，低濃度的Cu2+和Zn2+可能會刺激細(xì)胞的酶學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)。對比某煤化工企業(yè)同批次樣品檢測數(shù)據(jù)，進(jìn)出水的Cu2+質(zhì)量濃度差異不大，為0.009 mg∕L 左右，而進(jìn)出水的Zn2+質(zhì)量濃度均為＜0.05 mg∕L，該煤化工企業(yè)廢污水樣品的Cu2+和Zn2+質(zhì)量濃度不是造成出水發(fā)光量增加的原因，影響細(xì)菌發(fā)光量增加的因素較為復(fù)雜，需進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

（1）某煤化工企業(yè)污水處理廠收集的進(jìn)水具有高毒性，但經(jīng)過目前運行A∕O（前置反硝化）生化處理+曝氣生物濾池（BAF）工藝處理后，毒性有較大程度的消減，出水無明顯的綜合毒性。

（2）廢污水的CODnb值高時，細(xì)菌毒性實驗的發(fā)光抑制率也高，廢污水的CODnb值低時，細(xì)菌毒性實驗的發(fā)光抑制率相應(yīng)低，甚至出現(xiàn)細(xì)菌發(fā)光量增長的現(xiàn)象。

（3）煤化工企業(yè)廢污水成分復(fù)雜，不同工藝路線產(chǎn)生的廢污水特征污染物也各不相同，除急性毒性外，還存在慢性毒性和基因性毒性等，不同生物對毒性的耐受能力和毒素在體內(nèi)的積累程度也不同。發(fā)光細(xì)菌法屬于急性毒性測試，雖存在一定的局限性，但其快速、簡便、高敏感性的優(yōu)勢可在企業(yè)污水處理廠的日常排水急性毒性的檢測和污染物超標(biāo)預(yù)警中發(fā)揮重要作用。