周明輝，王學亞，楊 壯，楊代虎

（合肥師范學院生命科學學院，安徽合肥 230061）

活性染料分子結構復雜且極為穩(wěn)定，具有抗光、抗酸、抗堿等特性，通常溶于水，在諸多行業(yè)中應用廣泛，大部分為難降解有毒有機物，具有致畸、致癌、致突變等作用〔1-3〕。因此，對活性染料生產(chǎn)與使用中產(chǎn)生的廢水進行處理就顯得尤為重要，目前，活性染料廢水的脫色和處理主要有物理、化學和生物方法，其中物理和化學的方法脫色效果較差，處理成本較高，而且應用范圍狹窄，而生物法具有易操作、高效、低成本、無二次污染等特點，得到廣泛應用〔4〕。獲取高效的染料降解菌是生物處理法的重要基礎，近年來，對染料降解菌的研究主要集中在白腐真菌、酵母菌、細菌上，而對霉菌的研究還不夠深入［5-6〕，霉菌菌絲發(fā)達，生長迅速，形成菌絲球極易沉降，有較寬的pH 耐受范圍，有一定的機械強度，吸附能力強，無需載體，可直接應用于固定床或流化床等反應器通過吸附處理染料廢水〔7-8〕，具有很多先天優(yōu)勢，但目前開發(fā)應用不足。因此本課題從印染廢水中篩選脫色霉菌，并對多種活性染料進行脫色試驗，以篩選出脫色范圍較廣與脫色能力較優(yōu)的霉菌，并對優(yōu)勢脫色霉菌的脫色特性進行研究，為實際應用奠定一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

脫色霉菌：分離篩選于合肥某印染廠廢水。

活性染料，工業(yè)級，甲醇，色譜級；虎紅標準樣品：質(zhì)量分數(shù)≥98.0%；均采購于上海生物工程有限公司。

馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖12.0 g，蛋白胨4.5 g，KH2PO41.2 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，瓊脂18～25 g，1∕300孟加拉紅1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 自然，0.1 MPa滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

Beckman Allegra 64R 高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-2100雙光束紫外可見光分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；7890B-5977A色相質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 脫色霉菌的分離篩選及形態(tài)觀察

采集印染廠廢水稀釋103倍，吸取稀釋液0.1 mL涂布于馬丁氏固體培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)72 h，對生長出的菌落進行多次純化，觀察純化的霉菌菌落與孢子形態(tài)，并制作斜面，保藏備用。

2.2 篩選霉菌對活性染料的脫色效果

選取不同結構類型的活性染料26種，以每100 mL中加入50 mg 制成馬丁氏活性染料培養(yǎng)液。無菌水沖洗保藏菌株的斜面，制成1×106mL-1濃度的孢子懸液，分別吸取1 mL 孢子懸液接種到不同的馬丁氏活性染料培養(yǎng)液中，每組做3 個平行1 個對照，在28 ℃、轉速120 r∕min 的條件下振蕩培養(yǎng)72 h，進行脫色試驗，在活性染料對應的最大吸收波長下測量吸光度，計算脫色率。依據(jù)脫色率分析篩選霉菌的脫色效果與脫色范圍，并進一步篩選優(yōu)勢脫色霉菌，以進行后續(xù)試驗。

2.3 優(yōu)勢脫色菌株對活性染料脫色機理的研究

經(jīng)過初步脫色試驗，選取菌株脫色率在50%以上的活性染料作為研究對象，接種1 mL 濃度為1×106mL-1的優(yōu)勢菌株的孢子懸液于100 mL 0.05%活性染料培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r∕min連續(xù)振蕩培養(yǎng)120 h，每隔24 h 進行觀察，宏觀判斷脫色過程。分別收集脫色前（未加菌）和脫色后的培養(yǎng)液，在10 000 r∕min條件下離心10 min，取上清液，利用紫外可見分光光度計在200～800 nm 范圍內(nèi)進行掃描，分析脫色前后波譜的變化狀況；取脫色前后高速離心的上清液，真空冷凍干燥制成粉末，溶解在色譜甲醇中，10 000 r∕min條件下離心10 min，用0.45 μm 微孔濾膜過濾后用于GC-MS 分析。采用Trace GC Ultra 和ISQ ⅡMS對脫色產(chǎn)物進行分析，GC-MS 柱為TG-35 ms 的石英毛細管柱，柱溫設定從100 ℃程序升溫至300 ℃（10 ℃∕min），運行時間保持10 min；載氣（氦氣）流速為1 mL∕min；注射器和檢測器溫度為300 ℃，脫色產(chǎn)物的質(zhì)譜分析在EI 模式、70 eV 條件下進行滿掃。

2.4 優(yōu)勢脫色菌株的分子鑒定

經(jīng)脫色效果與機理的研究，選取脫色效果最優(yōu)的菌株進行基因測序，明確其種屬，為后續(xù)研究奠定基礎。

（1）霉菌DNA 的提取與聚合酶鏈反應（PCR）擴增采用真菌試劑盒提取菌株DNA 基因組，真菌試劑盒購自上海生物工程公司。根據(jù)真菌18SrDNA保守區(qū)設計引物，上游引物PA：（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和下游引物PB：（5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′），由上海生物工程公司合成，采用真菌常規(guī)的PCR 反應程序進行。

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析，將擴增產(chǎn)物送至上海生物工程公司進行序列測定，將所測序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性分析；選擇相應參比菌株序列，采用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.5 脫色率的計算

脫色率計算公式：

式中：D——脫色率，%；

m0——初始OD；

mn——脫色后的OD；

n——處理批次（n=0 1 2…n）。

3 試驗結果

3.1 脫色霉菌的篩選

從印染廠的廢水中分離篩選出3 株霉菌，經(jīng)過純化傳代培養(yǎng)，選取生長狀態(tài)穩(wěn)定的菌株作為研究對象，依次命名為YR01、YR02、YR03，霉菌菌落及孢子形態(tài)見圖1（菌落與孢子形態(tài)上下對應）。

由圖1 可知，3 株菌菌落具有明顯霉菌的特征，對菌絲進行染色顯微觀察，孢子形態(tài)符合青霉屬、根霉屬、曲霉屬的特征。

圖1 3 種霉菌菌落與孢子形態(tài)Fig.1 Colony and spore morphology of three kinds of mould

3.2 篩選霉菌對活性染料的脫色效果

利用菌株YR01、YR02、YR03 對26 種活性染料進行單一降解試驗，結果見表1。

表1 篩選霉菌對活性染料的脫色效果Table 1 The decolorization effect of reactive dye by screening mould

由表1 可知，除了在孔雀綠培養(yǎng)液中，3 株霉菌均能在所選染料中生長，但形成菌球的能力有所差異，在染液中成球度強弱順序為：YR03＞YR02＞YR01；3 株霉菌對大部分所選活性染料脫色效果并不顯著，尤其是對偶氮染料的處理，而對具有雜環(huán)氧蒽結構的染料降解效果較好。3 株霉菌對虎紅、藏青M-GD、曙紅B、胭脂紅、綠KE-4BD、翠蘭KN-G、艷蘭X-BR 的脫色效果更為顯著，菌株YR03 對活性染料的脫色效率最高，因此對該菌株作進一步脫色研究。

3.3 菌株YR03 脫色特性

選取菌株YR03 對7 種上述脫色效果較好的活性染料作120 h 連續(xù)脫色試驗，宏觀判斷脫色機理，結果見圖2～圖3。

圖2 菌株YR03 對7 種染料的脫色效果Fig.2 The decolorization effect of seven kinds of dye by strain YR03

圖3 菌株YR03 對虎紅脫色過程Fig.3 Decolorization process of tiger red by strain YR03

由圖2～圖3 可知，菌株YR03 經(jīng)過72 h 振蕩培養(yǎng)，已形成形態(tài)較為完整的菌球，菌球中吸附了大量染料，其中對虎紅的脫色率最高，達到90%以上。進一步延長菌株YR03 對以上7 種染料的脫色時間至96 h，發(fā)現(xiàn)含有虎紅染料的菌球中顏色逐漸褪去，至120 h，菌球中染料基本上完全降解，培養(yǎng)液完全澄清，其他菌球中的染料顏色無明顯變化。

由于菌株YR03 對虎紅染料具有完全脫色的作用，因此對其脫色前后的染液進行處理，在200～800 nm紫外可見與GC-MS 進行掃描，進一步了解脫色機理，結果見圖4。

由圖4（a）可知，300 nm 前的脫色前后的圖譜基本相似，250 nm 前的苯環(huán)精細結構并沒有變化，而脫色后在可見光區(qū)546 nm 處的吸收峰完全消失，且沒有形成其他明顯的吸收峰，在350～450 nm 處吸收峰有所升高，可能有新的物質(zhì)生成，由此說明，虎紅脫色后分子結構發(fā)生了變化，母體結構被破壞，引起虎紅染料由紅色變成無色，表明菌株YR03 對虎紅完全脫色是由生物降解引起的。

圖4 菌株YR03 虎紅脫色前后可見紫外吸收圖譜（a）和GC-MS（b）Fig.4 UV-vis absorption（a）and GC-MS spectrum（b）of tiger red before and after decolorization by strain YR03

由圖4（b）可知，虎紅脫色前主要物質(zhì)為虎紅分子，相對分子質(zhì)量為1 037，與虎紅質(zhì)譜圖相仿，保留時間為9.116 min，而降解后主要檢出相對分子質(zhì)量為286，保留時間為6.205 min，其特征離子片段分別為36、71、107、142、177、214、242，脫色前后圖譜發(fā)生明顯變化，說明虎紅分子被降解成相對分子更小的其他物質(zhì)。

3.4 菌株YR03 分子鑒定

由于菌株YR03 具有脫色范圍廣，脫色率高的優(yōu)勢，且對虎紅染料能進行完全脫色，具有較高的研究價值。因此對其進行分子測序并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定其種屬，為后續(xù)研究提供一定的基礎，結果見圖5。

圖5 菌株YR03 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain YR03

由圖5 可知，菌株YR03 基因序列與比對序列的相似度達到95%以上，結合圖1 菌株YR03 的菌落與孢子形態(tài)，確定菌株YR03 為1 株黑曲霉菌。

4 討論

霉菌因其獲取容易、菌絲體生長快、可形成菌絲球、吸附脫色能力強等優(yōu)點，在印染廢水脫色、去除重金屬污染、重金屬回收等方面應用廣泛〔9〕。霉菌中的青霉、曲霉、根霉較多地應用在染料廢水的處理中，其中青霉菌球形成能力弱，根霉對低濃度染料脫色效果好，而曲霉的成球效果好，對高濃度染料具有較好的脫色效果〔10〕，本試驗中也發(fā)現(xiàn)，黑曲霉對活性染料的脫色范圍與脫色效果均要優(yōu)于青霉與根霉屬。目前利用細菌與白腐真菌對染料的脫色研究較深入，并且對于偶氮染料的降解研究較多，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)是通過他們分泌的偶氮還原酶與木質(zhì)素過氧化物酶對染料進行降解的，且染料上的基團對降解起著促進與抑制的作用〔11-12〕。本課題通過所篩選的霉菌對26 種活性染料的脫色研究，發(fā)現(xiàn)對三苯烷類、偶氮類染料的脫色效果不佳，而對含有氧蒽類結構染料脫色較好，活性基團乙烯砜與側鏈鈉鹽數(shù)量對脫色具有促進作用。染料一般經(jīng)微生物吸附降解后，染料母體結構發(fā)生破壞，生成小分子物質(zhì)，光譜吸收峰也發(fā)生明顯改變〔13〕。所篩選的脫色霉菌對大部分活性染料的脫色均為吸附，僅有黑曲霉對虎紅的脫色存在著吸附后的降解，利用可見紫外掃描黑曲霉對虎紅脫色前后培養(yǎng)液，吸收光譜發(fā)生明顯變化，546 nm 下氧雜蒽結構的吸收峰消失，說明氧雜蒽結構被破壞；GC-MS 分析脫色前后產(chǎn)物顯示，染料的發(fā)色基團被破壞，生成更小的小分子物質(zhì)，因此虎紅被完全脫色，表明存在著酶降解過程，相關降解酶的參與以及降解過程中形成的小分子物質(zhì)還需進一步研究。