李遠(yuǎn)威 郝凱越 宗永臣 尤俊豪 郭明哲

(西藏農(nóng)牧學(xué)院水利土木工程學(xué)院，西藏 林芝 860000)

目前我國城鎮(zhèn)污水處理廠主要采用活性污泥法[1]，其中A2/O工藝由于運(yùn)行管理簡單、脫氮除磷效果好等應(yīng)用最為廣泛。污水處理工藝中脫氮除磷的效能與微生物菌屬功能、基因豐度以及各污染物代謝途徑緊密相關(guān)?？敌』2]98研究發(fā)現(xiàn)，在亞高原地區(qū)污水處理工藝中污水種類可影響功能蛋白種類，且豐度較高的酶和基因與微生物參與的碳代謝、氮代謝以及適應(yīng)環(huán)境變化方面的代謝有著密切的聯(lián)系。黃瀟[3]發(fā)現(xiàn)，在污水處理好氧區(qū)主要發(fā)生氮代謝，且水力停留時(shí)間(HRT)的延長有利于脫氮菌和有機(jī)物降解菌的生長，便于碳源、氮源的降解。彭永臻等[4]在活性污泥中發(fā)現(xiàn)固氮酶功能基因nifD，其主要參與的氮代謝途徑是生物脫氮的主體。崔迪[5]發(fā)現(xiàn)，活性污泥中以碳、氮和磷代謝為主，其中碳代謝提供的碳源確保了微生物群落的基本生長要求，便于后續(xù)生物代謝反應(yīng)的進(jìn)行。然而，上述研究多在平原或亞高原地區(qū)展開，針對(duì)高原生境下活性污泥代謝途徑和基因豐度等方面的研究較少。西藏自治區(qū)位于青藏高原西南部，平均海拔在4 000 m以上，為進(jìn)一步提升高原生境下污水處理效能，本研究在西藏農(nóng)牧學(xué)院校區(qū)內(nèi)構(gòu)建A2/O工藝試驗(yàn)裝置，考察了在不同HRT條件下污泥系統(tǒng)的優(yōu)勢菌屬功能和污染物代謝途徑等情況，探討了微生物代謝功能等規(guī)律，以期為高原生境下活性污泥微生物代謝機(jī)制的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)和方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用A2/O工藝小試裝置，其中反應(yīng)池總體積為210 L，其中厭氧池、缺氧池、好氧池體積分別為35、58、117 L，二沉池體積為39 L。試驗(yàn)過程中，厭氧池和缺氧池利用爪極式永磁同步電機(jī)配合攪拌器進(jìn)行攪拌，好氧池利用交直流增氧泵和空氣浮子流量計(jì)進(jìn)行曝氣[6]。采用磁力驅(qū)動(dòng)循環(huán)泵控制污泥回流比為100%，采用蠕動(dòng)泵控制硝化液回流比為200%。利用好氧池進(jìn)行35 d的活性污泥培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(20.0±0.5) ℃，溶解氧(DO) 2.0～3.0 mg/L，pH 6.50～7.50。培養(yǎng)階段結(jié)束時(shí)，測得污泥沉降比(SV30)為28%，混合液懸浮固體質(zhì)量濃度(MLSS)為3 716 mg/L，污泥達(dá)到預(yù)定要求后開展正式試驗(yàn)。本試驗(yàn)直接采用校園生活污水為試驗(yàn)用水，主要進(jìn)水水質(zhì)指標(biāo)見表1。

表1 試驗(yàn)用水水質(zhì)指標(biāo)

1.2 試驗(yàn)方法

保持污泥培養(yǎng)階段時(shí)的控制指標(biāo)不變，利用流量計(jì)調(diào)節(jié)進(jìn)水流量分別為8、10、12、14 L/h，對(duì)應(yīng)的HRT為26.25、21.00、17.50、15.00 h，每種HRT工況連續(xù)運(yùn)行9 d，每天持續(xù)監(jiān)測進(jìn)出水COD、TN、TP、氨氮指標(biāo)，檢測方法參照文獻(xiàn)[7]。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)好氧池活性污泥進(jìn)行取樣，預(yù)處理后送樣檢測。為消除工況調(diào)整的影響，每一工況運(yùn)行結(jié)束后間隔72 h后開展下一工況試驗(yàn)。

1.3 活性污泥預(yù)處理及分析

1.3.1 活性污泥樣品預(yù)處理

采集好氧池中泥水混合液裝入已滅菌的離心管中，利用高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min對(duì)活性污泥進(jìn)行富集[8]，然后置于超低溫冷凍儲(chǔ)存箱-80 ℃冷凍24 h，進(jìn)行高通量16S rRNA基因測序分析。

1.3.2 測序分析流程

首先利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA，設(shè)計(jì)引物接頭并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增與產(chǎn)物純化，對(duì)指定區(qū)域合成barcode特異引物。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量工藝進(jìn)行檢測，利用Illumina技術(shù)進(jìn)行16S rRNA測序分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 進(jìn)水水質(zhì)及污染物去除率分析

不同HRT工況下A2/O工藝平均進(jìn)出水水質(zhì)及污染物去除率見表2。

表2 不同HRT下平均進(jìn)出水水質(zhì)及污染物去除率

由表1可見，當(dāng)HRT為26.25 h時(shí)，出水COD達(dá)到了《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18918—2002)一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(50 mg/L)[9]，此時(shí)COD去除率最高為85.90%，其余各工況出水均未達(dá)到GB 18918—2002一級(jí)B標(biāo)準(zhǔn)(60 mg/L)。TN在各HRT工況下均達(dá)到了GB 18918—2002一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(15 mg/L)，但在HRT為21.00 h時(shí)TN去除率最高，達(dá)到73.68%。TP在各HRT工況下出水均滿足一級(jí)B標(biāo)準(zhǔn)(1.5 mg/L)，其中在HRT為26.25 h時(shí)去除率最高(81.54%)。出水氨氮在4種HRT工況下均達(dá)到GB 18918—2002一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(5 mg/L)，在HRT為15.00 h時(shí)去除率最高(93.17%)。綜合上述分析可知，TN和氨氮出水水質(zhì)均滿足GB 18918—2002一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，即表明HRT的長短對(duì)TN和氨氮的去除無明顯影響；COD在HRT為26.25 h時(shí)去除效果最好，這與郝凱越等[10]研究一致。綜合考慮氨氮雖在HRT為15.00 h時(shí)處理效果最好，但此時(shí)COD去除效果較差，而HRT為26.25 h時(shí)4種污染物均有較好的去除效果，故優(yōu)先選擇26.25 h為最佳的HRT運(yùn)行工況，以便高效地去除污染物。HRT的變化會(huì)影響微生物群落多樣性指數(shù)變化[11-12]和功能菌屬豐度變化[13]，微生物群落的變化可以進(jìn)一步導(dǎo)致出水水質(zhì)發(fā)生變化。

2.2 A2/O工藝好氧池優(yōu)勢菌屬功能分析

采用SPSS 22.0軟件依據(jù)silva數(shù)據(jù)庫對(duì)4個(gè)HRT工況下好氧池的污泥樣本展開統(tǒng)計(jì)分析，利用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目(RDP)分類和功能預(yù)測軟件(PICRUSt)篩選出已知功能分類和代謝類型的前10種菌屬，詳細(xì)信息見表3。

由表3可見，腐螺旋菌屬[14]、鞘脂菌屬[15-16]和克里斯滕森菌科R-7群[17]為有機(jī)物降解菌；奧托氏菌屬[18]、孤島桿菌屬[19]、norank_f_JG30-KF-CM45和貪食菌屬[20]為反硝化菌；熱單胞菌屬[21]和產(chǎn)黃桿菌[22]為雙重屬性菌，既可以利用反硝化作用脫氮又可利用聚磷菌特有的聚磷功能除磷；戈登氏菌屬為典型聚磷菌，在污水處理除磷功能中占據(jù)主導(dǎo)地位。綜上可知，優(yōu)勢菌屬主要代謝功能為有機(jī)物降解、反硝化脫氮和聚磷菌除磷。

表3 A2/O工藝好氧池前10種優(yōu)勢菌屬功能分類

2.3 微生物群落代謝途徑分析

2.3.1 A2/O活性污泥微生物群落主要代謝途徑

為了進(jìn)一步研究A2/O工藝中微生物群落各污染物代謝途徑，通過與京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫中基因功能比較，共獲得239條代謝途徑，篩選出豐度最大的前10條代謝途徑并對(duì)代謝功能信息進(jìn)行注釋，不同HRT工況下各種代謝途徑豐度值信息見表4。

表4 活性污泥微生物群落前10條代謝途徑豐度

由表4可見，不同HRT工況下豐度最高的代謝功能為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ko02010)，說明微生物細(xì)胞運(yùn)輸各類污染物、無機(jī)鹽離子等物質(zhì)較多，保證了各污染物代謝所需的營養(yǎng)條件；其次為細(xì)菌雙組分調(diào)節(jié)功能(ko02020)，其主要作用為及時(shí)響應(yīng)外界環(huán)境變化，做出利于自身生長的變化，在適應(yīng)環(huán)境變化中有顯著作用[23]，該代謝途徑豐度僅次于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，顯然在應(yīng)對(duì)高原獨(dú)特的環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。嘌呤代謝(ko00230)、核糖體功能(ko03010)、嘧啶代謝(ko00240)等豐度也較高，均與污染物去除密切相關(guān)。此外，氧化磷酸化(ko00190)是磷代謝的主要途徑；丁酸代謝(ko00650)和丙酮酸代謝(ko00620)是碳代謝的主要途徑；精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)等是典型的氮代謝的主要途徑之一。綜上可知，高原生境下不同HRT工況的A2/O工藝中主要代謝途徑為碳氮磷的代謝。代謝途徑豐度的不同表明了微生物群落結(jié)構(gòu)的不同，調(diào)節(jié)HRT導(dǎo)致了A2/O工藝中群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，不同群落結(jié)構(gòu)組成導(dǎo)致了各污染物去除效果的好壞。從表4可以看出，HRT為26.25 h時(shí)各種代謝途徑的豐度均最大，此時(shí)各種污染物代謝反應(yīng)迅速，細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)最活躍，污染物處理效能最佳。

2.3.2 微生物群落碳代謝途徑

分析活性污泥樣品中的功能基因，發(fā)現(xiàn)5 582個(gè)功能基因參與各污染物的代謝途徑，選取參與碳代謝途徑的前10種功能基因并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，具體信息見表5。

由表5可見，碳代謝途徑主要集中在脂肪酸代謝(ko00071)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、脂肪酸生物合成(ko00061)、糖酵解/糖異生(ko00010)和丙酮酸代謝(ko00620)等途徑[24]，脂肪酸、糖類和脂質(zhì)代謝途徑較多，與生活污水常見成分相關(guān)。本研究中試驗(yàn)用水碳氮比在8.30～11.62波動(dòng)，確保了充足的碳源供應(yīng)，因此碳代謝途徑十分豐富。酶功能分類主要集中在脫氫酶、水合酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶等。酶類分布以脫氫酶豐度最大，說明細(xì)胞代謝反應(yīng)以氧化還原反應(yīng)為主，主要消耗各類有機(jī)污染物，為細(xì)胞間的生命活動(dòng)提供充足的碳源，也可高效去除污水中的有機(jī)物。其余酶類種類較多，表明微生物內(nèi)部其他各類酶促反應(yīng)較多，為微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)提供了生存環(huán)境和能源供應(yīng)。

表5 碳代謝途徑的前10種功能基因

2.3.3 微生物群落氮代謝途徑

生活污水中氮素的含量較高，脫氮的過程一般為硝化反應(yīng)、反硝化反應(yīng)與氨化反應(yīng)[25-27]，即主要通過硝化菌、反硝化菌(DNB)和氨氧化菌(AOB)將有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨(dú)?，這也是污水處理中主要的生物脫氮途徑。選取參與氮代謝途徑前10種功能基因并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，具體信息見表6。

由表6可見，氮代謝途徑主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250)、氮代謝(ko00910)和精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)等途徑。與氮代謝相關(guān)的基因和酶參與氨基酸的合成分解代謝、硝化、反硝化和氨化反應(yīng)一致，說明微生物細(xì)胞的氮代謝途徑種類多且豐度較大，有利于以氨基酸為底物的生化反應(yīng)的進(jìn)行。另外，細(xì)菌雙組分調(diào)節(jié)(ko02020)代謝途徑的基因豐度最大，表明微生物細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境變化能力強(qiáng)。酶類分布以合成酶、脫氫酶和酸合酶為主，其中豐度最大的是合成酶，表明氮代謝途徑主要以氨基酸代謝為主，通過合成氨基酸類物質(zhì)，為構(gòu)造大分子蛋白質(zhì)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，不斷完善微生物脫氮系統(tǒng)的完整性從而消耗污水中的氮素。

表6 氮代謝途徑的前10種功能基因

2.3.4 微生物群落磷代謝途徑

生物除磷的主要途徑是依靠聚磷菌聚磷，以此來消耗污水中的磷元素從而達(dá)到除磷的目的[28]。選取參與磷代謝途徑前10種功能基因并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行分析，具體信息見表7。

由表7可見，磷代謝主要途徑是氧化磷酸化(ko00190)，參與磷代謝的基因都具備此項(xiàng)代謝途徑。其中F型轉(zhuǎn)運(yùn)H+的ATP酶類數(shù)量和種類最多，表明轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶類數(shù)量多且對(duì)應(yīng)基因豐度較大，其主要為細(xì)胞代謝和生命活動(dòng)提供充足的能源支撐，從而使細(xì)胞利用氧化磷酸化途徑來消耗污水中的磷。另外，氧化酶和脫氫酶數(shù)量也占據(jù)一定比例，在好氧條件下氧化磷酸化反應(yīng)速度快，聚磷菌的微生物代謝較快，為除磷提供了有力的條件，導(dǎo)致除磷效果的提高。

表7 磷代謝途徑的前10種功能基因

2.4 A2/O工藝微生物功能基因豐度分析

將污泥樣品基因數(shù)據(jù)信息與KEGG數(shù)據(jù)庫中已知基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5 752個(gè)同源基因，選取不同HRT下活性污泥群落微生物細(xì)胞豐度排在前10的功能基因并對(duì)其名稱和基因功能進(jìn)行分析，具體信息見表8。

由表8可見，本研究豐度排名前10的功能基因中有7個(gè)與亞高原地區(qū)城市污水系統(tǒng)的功能基因相同[2]103，其中rpoE基因是革蘭氏陽性調(diào)節(jié)基因，主要面對(duì)外界環(huán)境的變化作出反應(yīng)，便于適應(yīng)當(dāng)前生存環(huán)境，且該基因豐度明顯高于亞高原地區(qū)，推測因高原特殊生境造成該基因不斷表達(dá)自身基因功能來適應(yīng)高原特殊生境。ABC.CD.P、ABCB-BAC和ABC.CD.A屬于轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白基因，主要與各污染物的轉(zhuǎn)化和分解有關(guān)。paaF和echA基因的產(chǎn)物是烯酰輔酶A水合酶，主要作用是參與氨基酸降解和碳固定等多種碳、氮代謝途徑。fabG、OAR1基因的產(chǎn)物是3-氧代酰基-[?；d體蛋白]還原酶，該酶主要參與碳代謝途徑。drrA基因的產(chǎn)物是抗生素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ATP結(jié)合蛋白，主要作用是減輕抗生素對(duì)細(xì)胞的毒性，使細(xì)胞群落適應(yīng)在抗生素環(huán)境中生存。另外，高原生境下特有的功能基因號(hào)有：K02014(TC.FEV.OM)、K00626(ACAT、atoB)、K00257(mbtN、fadE14)。TC.FEV.OM基因的產(chǎn)物是鐵復(fù)合物外膜受體蛋白，主要作用是污染物利用該受體蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)完成污染物的降解。ACAT、atoB基因的產(chǎn)物是乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶，該酶主要參與各種氨基酸代謝的氮代謝途徑。mbtN、fadE14的產(chǎn)物是?；鵄CP脫氫酶，主要參與氧化還原反應(yīng)降解污染物。豐度前10的功能基因中僅有3個(gè)碳代謝優(yōu)勢基因存在，氮和磷代謝優(yōu)勢基因均不存在，即在基因水平仍以碳代謝途徑為主。由以上分析可知，高原生境下A2/O工藝活性污泥微生物功能基因中以碳代謝途徑的基因偏多，基因豐度相對(duì)最大，說明在各好氧池中有機(jī)物去除功能較完善。另外，不同HRT下功能基因豐度排序?yàn)?6.25 h>17.50 h>15.00 h>21.00 h，表明HRT為26.25 h時(shí)活性污泥系統(tǒng)功能基因發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程最多，參與各種蛋白質(zhì)表達(dá)和污染物代謝的功能越強(qiáng)大。因此，在基因水平上進(jìn)一步說明26.25 h是最佳的HRT運(yùn)行工況。

表8 不同HRT下活性污泥群落微生物細(xì)胞主要功能基因豐度

3 結(jié) 論

對(duì)高原生境下A2/O工藝污染物去除效果及好氧池中活性污泥優(yōu)勢菌功能、代謝途徑和基因豐度進(jìn)行分析，探討不同HRT工況下A2/O工藝微生物代謝機(jī)制，結(jié)果表明：高原生境下，A2/O工藝HRT為26.25 h污水處理效果最好，微生物優(yōu)勢菌屬代謝功能以有機(jī)物降解、反硝化脫氮和聚磷菌除磷為主，這與污水中常含此類污染物有關(guān)；微生物群落代謝途徑分析可知，應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的細(xì)菌雙組分調(diào)節(jié)(ko02020)豐度較大，該代謝途徑在適應(yīng)環(huán)境變化中有顯著作用，并在HRT為26.25 h時(shí)達(dá)到最大值，是高原生境下的優(yōu)勢代謝途徑；根據(jù)功能基因豐度分析，發(fā)現(xiàn)高原生境下活性污泥微生物細(xì)胞中rpoE基因豐度偏大，凸顯高原生境對(duì)優(yōu)勢基因功能有一定的選擇性， HRT為26.25 h時(shí)微生物中細(xì)胞功能基因豐度最大，即發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程最多，參與各種蛋白質(zhì)表達(dá)和污染物代謝的功能越強(qiáng)大，進(jìn)一步證實(shí)了優(yōu)勢菌屬功能和代謝途徑豐度最大的原因，與水質(zhì)分析結(jié)果一致。因此，26.25 h是高原生境下A2/O工藝最佳的HRT運(yùn)行工況。