林進(jìn)生

（福建片仔癀化妝品有限公司，福建漳州，363000）

蛇床子為傘形科蛇床屬植物蛇床（Cnidiummon?nieri（L.）Cuss.）的干燥成熟果實(shí)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為蛇床子味辛、苦，性溫，歸腎經(jīng)，具有燥濕祛風(fēng)、殺蟲(chóng)止癢、溫腎壯陽(yáng)的作用，常用于治療陽(yáng)痿、濕痹腰痛、急性滲出性皮膚病等疾病。現(xiàn)代分析表明，蛇床子所含的主要化學(xué)成分為香豆素、色原酮類(lèi)、苯并呋喃類(lèi)等化合物，其中最為關(guān)鍵的活性成分為蛇床子素［1-2］。

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚、歐芹酚甲醚，化學(xué)名稱(chēng)為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素［3］，屬于香豆素類(lèi)化合物。蛇床子素廣泛存在于傘形科植物中，是植物中呋喃香豆素的代表性物質(zhì)［4］。從大量研究表明，蛇床子素及其衍生物具有降血壓、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌［5-11］等多種生物活性，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等方面的疾病都有良好的治療效果。

本研究通過(guò)對(duì)蛇床子素高效液相色譜測(cè)定方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的考察，確定了適于蛇床子中蛇床子素測(cè)定的參數(shù)指標(biāo)，并測(cè)定了不同蛇床子樣品中蛇床子的素含量，以期為蛇床子和蛇床子素的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蛇床子（亳州市弘寶堂商貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑儀器

蛇床子素對(duì)照品（分析標(biāo)準(zhǔn)品≥99.5%，阿拉丁科技有限公司）；甲醇（北京生化科技有限公司）；乙腈（北京生化科技有限公司）；乙醇（南京化學(xué)試劑有限公司）。

Waters E2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；UTP-313型電子天平（上海花潮電器有限公司）；KQ－210A型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；FSJ-A03D1小型粉碎機(jī)（小熊電器股份有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（蘇州賽恩斯儀器有限公司）；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備

采用乙醇回流法提取蛇床子中蛇床子素。準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g蛇床子藥材，放入小型粉碎機(jī)粉碎。圓底燒瓶中按料液比1：15加入30%乙醇進(jìn)行熱回流提取，分兩次提取，每次提取時(shí)間為3 h。提取后溶液放置室溫后過(guò)濾，3500 r/min離心15 min離心后抽濾，得到上清液即為蛇床子提取液。將蛇床子提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器減壓回收溶劑直至浸膏狀態(tài)，放入真空干燥箱烘干后得到蛇床子提取物。提取物中加入適量甲醇配置成供試樣品溶液，通過(guò)0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取蛇床子素對(duì)照品2.500 mg，加甲醇定容至25 mL棕色量瓶中，搖勻，制得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 色譜條件

色譜柱選擇Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸（體積比70：30）。檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10μL，柱溫為30℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件分析

按照色譜條件，將對(duì)稀釋為50μg/mL的對(duì)照品溶液和供試樣品溶液分別進(jìn)樣分析，得圖譜如圖1-2所示。分析可知，在以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸（體積比70：30）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為30℃檢，測(cè)波長(zhǎng)為322 nm的液相色譜條件下，蛇床子素具有明顯的特征性吸收峰，特征峰的出峰時(shí)間為8.355 min。供試樣品溶液中的蛇床子素在此色譜條件下，實(shí)現(xiàn)了其它物質(zhì)的分離，特征峰明顯，出峰時(shí)間為8.398 min。表明該色譜條件適于蛇床子中蛇床子素的測(cè)定。

圖1 對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogramof reference substance

2.2 線性關(guān)系考察

將蛇床子素對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成12.5、25、50、100、200μg/mL進(jìn)樣液，分別進(jìn)行進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣液中蛇床子素的濃度為橫坐標(biāo)，以特征峰的峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出蛇床子素的線 性 回 歸 方 程 為Y=4.172×104X+1.912×102，R2=0.999 6。結(jié)果表明，蛇床子素的濃度在12.5～200μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與進(jìn)樣液中蛇床子素濃度具有良好的線性關(guān)系。

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of test article

2.3 精密度考察

按照色譜條件，重復(fù)6次對(duì)供試樣品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，并根據(jù)特征峰峰面積，通過(guò)回歸方程計(jì)算供試樣品中蛇床子素的平均含量為5.12±0.04%。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出RSD為1.28%（n=6），小于3.0%，表明該方法的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取蛇床子供試樣品品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)行進(jìn)樣分析。通過(guò)蛇床子素的峰面積計(jì)算供試品中蛇床子素的含量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD為1.32%（n=7），小于3.0%，表明在本方法條件下，蛇床子供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性考察

取同一蛇床子樣品分成6份，分別按照試驗(yàn)方法提取制成供試樣品溶液，按色譜條件分別進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定結(jié)果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出RSD為0.87%（n=6），小于3.0%，表明其重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率測(cè)定

分別精密吸取蛇床子素對(duì)照溶液2、2、3、3、4、4 mL，放置于20 mL容量瓶中，揮干。取6份已知含量的供試樣品溶液加入容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋至刻度，分別取20μL注入高效液相色譜儀器中，按照色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)回歸方程計(jì)算蛇床子素含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蛇床子素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of recovery of osthol

由表1分析可知，該方法平均加樣回收率為99.36%，加樣回收的RSD為1.53%，表明該方法測(cè)定蛇床子素含量具有良好的準(zhǔn)確度。

2.6 樣品含量測(cè)定

取3批蛇床子藥材制成供試品溶液，按照色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算蛇床子素在蛇床子中的含量。結(jié)果見(jiàn)表2，所測(cè)樣品中蛇床子素含量分別為5.47%、5.56%和5.71%，同批次內(nèi)樣品的蛇床子素含量測(cè)定值的RSD值分別為1.36%、1.52%、1.17%，表明研究所確定的測(cè)定方法對(duì)不同蛇床子樣品中蛇床子素的測(cè)定均有較高的準(zhǔn)確度。

3 討論

蛇床子素作為植物中呋喃香豆素的代表性物質(zhì)，大量研究表明其具有降血壓、抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多種生物活性，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等方面的疾病都有良好的治療效果。尤其是近年來(lái)的研究表明，蛇床子素對(duì)癌癥、腦退化疾病都有較好療效，這對(duì)于醫(yī)學(xué)和社會(huì)都具有重大價(jià)值，隨著現(xiàn)代科學(xué)研究的不斷深入，蛇床子素將在臨床上展現(xiàn)出更廣闊的前景。

本研究通過(guò)對(duì)蛇床子素高效液相色譜測(cè)定方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的考察，確定了適于蛇床子中蛇床子素HPLC測(cè)定的條件為：以Aglient C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸（體積比70：30）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為322 nm。通過(guò)該方法測(cè)定不同蛇床子樣品中蛇床子素的平均含量為5.58%。