羅可，劉添皇

（廣東省梅州市人民醫(yī)院肝病科，廣東梅州514031）

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第6 位[1-3]。在原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占85%～90%，是肝癌最主要的病理學(xué)類型。HCC 的惡性程度高，早期癥狀隱匿，大部分患者就診時(shí)已經(jīng)是中晚期，其治療效果不佳[3-4]。根治性切除是HCC 的主要治療方法，但是大部分患者在手術(shù)之后不可避免存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致患者死亡。HCC 對(duì)傳統(tǒng)的放化療抵抗，早期診斷和及早識(shí)別復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高危HCC 患者是進(jìn)一步提高肝癌預(yù)后的關(guān)鍵[5-6]。

腫瘤細(xì)胞在死亡機(jī)制方面往往存在某種缺陷，這也是導(dǎo)致惡性腫瘤治療失敗的一個(gè)重要原因。為了滿足生長(zhǎng)的需要，腫瘤細(xì)胞比普通非腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵的需求量通常更高。這種對(duì)鐵的依賴使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生鐵催化相關(guān)的死亡，即鐵死亡[7-9]。鐵死亡是鐵離子依賴型的細(xì)胞壞死，是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡類型，不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡和壞死，它是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累的結(jié)果[10-11]。越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡可作為抗腫瘤作用的新靶點(diǎn)[12-14]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體相關(guān)凋亡因子2（apoptosis-inducing factor, mitochondrionassociated 2，AIFM2）是一個(gè)鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子[15-16]。AIFM2 通過編碼黃素蛋白氧化還原酶與DNA 單鏈結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-19]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，AIFM2 是P53 靶向調(diào)控基因，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。AIFM2 在乳腺癌和小細(xì)胞肺癌中具有非常重要的調(diào)控作用，AIFM2 在核內(nèi)累積可引發(fā)細(xì)胞死亡[20]。

目前，關(guān)于AIFM2 在HCC 中的表達(dá)及功能尚不清楚，AIFM2 的表達(dá)與HCC 患者的臨床病理因素的關(guān)系也是未知。因此，本研究選取AIFM2 基因作為本研究的研究目標(biāo)，通過生物信息學(xué)全面分析AIFM2 基因在HCC 中的表達(dá)和相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HCC 診斷和預(yù)后判定提供潛在的新的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine數(shù)據(jù)庫 （https://www. oncomine. org/resource/login.html）是一個(gè)惡性腫瘤相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)，該數(shù)據(jù)庫收集了大量癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)資料，包括癌組織和正常組織的DNA 和RNA 的檢測(cè)數(shù)據(jù)，以及相關(guān)患者的臨床資料[21]。本研究納入Oncomine 數(shù)據(jù)庫多個(gè)HCC 研究數(shù)據(jù)隊(duì)列，包括Chen liver，Wurmbach liver 研究等。在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中，比較AIFM2 在HCC 組織和正常組織的中表達(dá)差異，當(dāng)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 UALCAN分析

UALCAN （http://ualcan.path.uab.edu） 是一個(gè)基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的在線分析平臺(tái)。UALCAN 數(shù)據(jù)平臺(tái)可以方便快速的獲取TCGA 數(shù)據(jù)庫內(nèi)的癌癥測(cè)序數(shù)據(jù)，可以用來探討基因表達(dá)與患者的臨床病理特征以及總生存之間的關(guān)系，也可用來分析基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)性[22]。本研究通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析AIFM2 在HCC 中的表達(dá)及意義。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析HCC 中AIFM2 的表達(dá)水平，并分析其與腫瘤分期、種族、性別、病理亞型等之間的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析。

1.3 LinkedOmics分析

LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org/login.php）是一個(gè)基于網(wǎng)頁的平臺(tái)，可用于分析32 個(gè)與TCGA 癌癥相關(guān)的多維數(shù)據(jù)集[23]。本研究通過LinkedOmics 研究TCGA 數(shù)據(jù)庫HCC 組織中的AIFM2表達(dá)對(duì)患者腫瘤大?。═ 分期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M 分期）、年齡、種族和預(yù)后等的影響。隨后，利用LinkFinder 模塊分析TCGA 數(shù)據(jù)庫HCC 隊(duì)列中與AIFM2 相關(guān)的差異表達(dá)基因，根據(jù)Pearson 相關(guān)系數(shù)分析在HCC 中與AIFM2 顯著表達(dá)相關(guān)的基因，結(jié)果以火山圖和熱圖顯示。利用 LinkFinder 模塊基因富集分析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 對(duì)差異相關(guān)基因進(jìn)行GO[細(xì)胞成分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）]分析，KEGG 信號(hào)通路分析、激酶靶標(biāo)富集、miRNA 靶標(biāo)富集和轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)富集。

1.4 cBioPortal分析

cBioPortal 是一種開放獲取的網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)資源，可用于多種癌癥的基因組學(xué)數(shù)據(jù)的綜合性探索，可用于探索基因的突變，拷貝數(shù)變異（CNV）和mRNA 表達(dá)情況[24]。本研究中，使用cBioPortal 分析TCGA 數(shù)據(jù)中372 例HCC 標(biāo)本中的AIFM2 基因變異頻率和類型。

1.5 GeneMANIA分析

GeneMANIA 在線數(shù)據(jù)庫（http://www.genemania.org）是一個(gè)可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，該平臺(tái)可以根據(jù)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別和擴(kuò)展指定基因功能相似的基因列表[25]。GeneMANIA 還可以根據(jù)每個(gè)所選查詢數(shù)據(jù)集的預(yù)測(cè)值進(jìn)行權(quán)重評(píng)估。本研究采用GeneMANIA 平臺(tái)探討AIFM2 可能存在相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 HCC 中AIFM2 的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性

Oncomine 4.5 數(shù)據(jù)庫的多個(gè)數(shù)據(jù)隊(duì)列分析顯示，在HCC 組織中AIFM2 的mRNA 表達(dá)和DNA 拷貝數(shù)均明顯高于正常組織（P＜0.01）（圖1）。從整合TCGA 數(shù)據(jù)集的UALCAN 網(wǎng)站進(jìn)一步分析AIFM2在TCGA 數(shù)據(jù)庫的HCC 中的表達(dá)情況，同時(shí)基于腫瘤臨床分期、病理亞型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)等進(jìn)行了分組分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HCC 中AIFM2 水平明顯高于正常組織（P＜0.001）（圖2A）；腫瘤分期越晚、病理分級(jí)越高，AIFM2 的表達(dá)量也越高（均P＜0.001）（圖2B-C）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1）患者的AIFM2 表達(dá)量顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）的患者（P＜0.001）（圖2D）；AIFM2 在HCC 中的表達(dá)量隨著患者年齡的增高而逐漸增高（P＜0.001）（圖2E）；伴有TP53 基因突變患者的AIFM2 表達(dá)量也顯著高于非TP53 基因突變的患者（P＜0.001）（圖2F）；腫瘤高分化患者的AIFM2 表達(dá)量顯著高于低分化的患者（P＜0.001）（圖2G）。AIFM2 的表達(dá)水平與患者的總生存（overall survival，OS）明顯相關(guān)，AIFM2 高表達(dá)患者的預(yù)后顯著差于低表達(dá)患者（P=0.034）（圖2H）。

2.2 HCC中AIFM2的相關(guān)性表達(dá)分析

為了明確AIFM2 的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過Person相關(guān)性分析探討與AIFM2 表達(dá)顯著相關(guān)的基因（圖3A），結(jié)果提示TYSND1、DNAJB12、MRPS16、EXOSC1和CUTC是與AIFM2呈正相關(guān)最明顯的前5個(gè)基 因（圖3B）， 而PDLIM5、 FNIP2、 AKAP9、PPAP2B 和BRWD1 是與AIFM2 負(fù)相關(guān)差異最顯著的前5 個(gè)基因（圖3C）。

2.3 GO功能注釋和KEGG信號(hào)通路分析

在LinkedOmics 數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，對(duì)AIFM2 及其在HCC 中顯著表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行GSEA 富集分析，其富集的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在核糖體和線粒體結(jié)構(gòu)組成、轉(zhuǎn)錄起始、NADH 還原酶、呼吸鏈傳遞、rRNA 結(jié)合和氧化磷酸化（圖4A-C）。通過KEGG 信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，AIFM2 及顯著相關(guān)基因在HCC 中主要參與了核糖體相關(guān)功能、氧化磷酸化、RNA 聚合酶和鐵死亡相關(guān)信號(hào)通路等（圖4D）。

2.4 HCC 中與AIFM2 表達(dá)相關(guān)的激酶、miRNA 或轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)

為了進(jìn)一步探索HCC 中AIFM2 的相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過GSEA 分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與AIFM2 表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的激酶、miRNA 和轉(zhuǎn)錄因子。與AIFM2 相關(guān)最顯著的前5 個(gè)激酶分別是激酶MAPK1、MAPK7、MAPK3、RPS6KA1 和FGR。與AIFM2 相關(guān)最顯著的前5 個(gè)miRNA 分別是miR-30 家族（miR30A-5P、miR-30C、miR-30D、miR-30B、miR-30E-5P）、 miR-1/206cluster、 miR-18 （miR-18a/b）、miR-183、miR-221/222 cluster。與AIFM2 相關(guān)最顯著的前5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別是NFAT、EN1、CEBP、PAX4 和PAX8（表1）。

2.5 HCC中AIFM2的基因組改變情況

鑒于AIFM2 在HCC 中存在mRNA 水平的轉(zhuǎn)錄異常，擬進(jìn)一步分析AIFM2 在DNA 層面是否存在異常改變。通過cBioPortal 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中372 例HCC 的突變頻率和類型，結(jié)果顯示372 例HCC 患者中只有5%患者的AIFM2 發(fā)生了改變（圖5）。這些改變包括：基因擴(kuò)增上調(diào)2 例（0.54%） 和mRNA上調(diào)15 例（4.03%）。因此，在HCC 中，AIFM2 的基因突變發(fā)生率非常低。

2.6 AIFM2的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

通過GeneMANIA 分析AIFM2 的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示：AIFM2 與氨甲基轉(zhuǎn)移酶（AMT）、抑癌基因TP53、硫代硫酸巰基轉(zhuǎn)移酶樣域含蛋白1（TSTD1）、D-2-羥基戊二酸脫氫酶（D2HGDH）、乳酸脫氫酶D（LDHD）等存在相互作用（圖6）。

3 討 論

HCC 是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型[26]。目前，HCC 的治療以手術(shù)、介入治療和靶向治療為主。雖然近年來各種治療手段的進(jìn)步，HCC 的預(yù)后較前明顯改善。但是，治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然非常常見。肝癌的早診早治是提高患者生存率的關(guān)鍵。因此，發(fā)現(xiàn)和鑒定更多分子標(biāo)志物用于肝細(xì)胞的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)是非常迫切的。鐵死亡是近年來一個(gè)研究的熱點(diǎn)，參與鐵死亡相關(guān)通路的基因被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著非常密切的關(guān)系。AIMF2 是一個(gè)鐵死亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控基因。但是，AIFM2 在HCC 中的診斷和預(yù)后價(jià)值目前尚不清楚。為了探討AIFM2 在HCC的診斷和生存預(yù)測(cè)中的價(jià)值，本研究通過生物信息學(xué)平臺(tái)分析AIFM2 是否與HCC 的臨床病理特征及生存預(yù)后相關(guān)，并挖掘AIFM2 在肝細(xì)胞中參與的各種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為闡明AIFM2 在HCC 中發(fā)揮的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

我們對(duì)AIFM2 在HCC 組織中表達(dá)水平進(jìn)行探討，并分析AIFM2 表達(dá)與HCC 的臨床病理因素是否相關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AIFM2 在HCC 中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，這就提示AIFM2 可能是個(gè)促癌因子。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AIFM2 的表達(dá)量與肝細(xì)胞的侵襲性顯著相關(guān)。AIFM2 在分期更晚或伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞中表達(dá)水平更高。此外，AIFM2 還與HCC 的分化有關(guān)，在低分化的HCC 中的AIMF2 的表達(dá)量顯著高于高分化的HCC。AIFM2在HCC 中表達(dá)水平還與抑癌基因TP53 的突變狀態(tài)顯著相關(guān)，伴有TP53 基因突變的AIFM2 表達(dá)量顯著高于非TP53 基因突變的患者。由此，推測(cè)AIFM2 可能與TP53 突變體存在調(diào)控關(guān)系。最后生存分析發(fā)現(xiàn)，AIFM2 的表達(dá)水平與HCC 的患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，AIFM2 高表達(dá)預(yù)示著HCC 患者的預(yù)后不良。這些結(jié)果說明，AIFM2 是HCC 潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。

鑒于AIFM2 與HCC 患者的預(yù)后顯著相關(guān)，筆者推測(cè)AIFM2 可能在HCC 中具備調(diào)控作用。因此，本研究探討了AIFM2 在HCC 中表達(dá)顯著相關(guān)的基因。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，AIFM2 和一些促癌基因具有顯著的關(guān)聯(lián)性，比如MRPS16 基因。MRPS16 可通過PI3K/Akt/Snail 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[27]。AIFM2 與卵泡蛋白相互作用蛋白FNIP2 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而FNIP2 在腎臟腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[28]，這也從另外一個(gè)方面提示AIFM2 可能發(fā)揮促癌作用。此外，本研究還通過GSEA 發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與AIFM2 相關(guān)聯(lián)的激酶、微小RNA （miRNA） 和轉(zhuǎn)錄因子。GO 和KEGG 分析表明，AIFM2 相關(guān)聯(lián)的基因主要富集在線粒體和核糖體功能相關(guān)通路，與細(xì)胞的氧化磷酸化和轉(zhuǎn)錄后翻譯等密切相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)HCC 癌中的AIFM2 的表達(dá)和MAP2K1/37、RPS6KA1和FGR 等蛋白激酶顯著相關(guān)。MAPK 激酶參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，該類激酶的過度激活與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。RPS6KA1 和FGR 激酶也是被廣泛報(bào)道參與腫瘤惡性進(jìn)展的蛋白激酶，亦是惡性腫瘤治療領(lǐng)域非常有潛力的靶點(diǎn)。

miRNA 主要通過與靶基因的3'UTR 完全或不完全結(jié)合來降解靶基因的mRNA 或抑制其翻譯過程，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和其他生命活動(dòng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與AIFM2 表達(dá)相關(guān)聯(lián)的miRNA，例如miR30 家族、miR18 和miR183。Croset 等[29]曾報(bào)道m(xù)iRNA-30 家 庭成員在乳腺癌主要發(fā)揮一個(gè)抑癌的作用，它們通過直接靶向多個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因來抑制乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。Sanchez-Mejias 等[30]發(fā)現(xiàn)在HCC 中miR-18a 的上調(diào)與患者預(yù)后不良以及促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖有關(guān)。

本研究為AIFM2 作為HCC 診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物提供了初步的證據(jù)。AIFM2 作為一個(gè)鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，在HCC 中能夠可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。AIFM2 在HCC 中與一些蛋白激酶（如MAPK3/7 和RPS6KA1）、miRNA（例如miR30 家族）和轉(zhuǎn)錄因子（如NFAT）等在表達(dá)上具有顯著的關(guān)聯(lián)性。這些研究結(jié)果為AIFM2 在HCC 中的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)，有望為HCC 的診療挖掘新的靶點(diǎn)。但是，本研究的結(jié)果主要根據(jù)生物信息學(xué)挖掘，尚未在臨床標(biāo)本進(jìn)行廣泛驗(yàn)證。因此，AIFM2 的表達(dá)對(duì)HCC 的影響及其具體分子機(jī)制需要后續(xù)仍進(jìn)一步研究。此外，AIFM2 對(duì)HCC 鐵死亡層面的影響值得進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。