凌林，胡明華，陳圣林，王靜，董娟

（1.華東師范大學(xué)附屬蕪湖醫(yī)院/安徽省蕪湖市第二人民醫(yī)院肝膽外科，安徽蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽蕪湖241000；3.皖南醫(yī)學(xué)院機能學(xué)實驗實訓(xùn)中心，安徽蕪湖241000）

肝是人體物質(zhì)代謝的中心器官，既往研究表明，具有強大的再生能力，增強肝的再生能力對肝疾病患者具有重要意義。在多達(dá)70%的肝組織切除后，肝殘余組織會迅速再生至其原始大小[1]。肝再生對肝功能的維持功能至關(guān)重要，然而目前對肝再生機制的了解不足，在一些肝纖維化患者中，在肝切除后會出現(xiàn)肝臟再生不足或未再生[2]。Ki-67 是細(xì)胞增殖過程中必不可少的蛋白，其水平升高提示肝細(xì)胞增殖能力的升高，可反映肝再生水平[3]。最新研究[4]顯示干細(xì)胞具有更強的增殖和分化潛能，并且能夠分化成肝細(xì)胞或者膽管上皮細(xì)胞。LGR5 基因是干細(xì)胞標(biāo)志蛋白，也是干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞的重要調(diào)控蛋白[5]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） 會激活Smad蛋白，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和分化，并促進(jìn)纖維化和傷口愈合[6]。有研究發(fā)現(xiàn)在肝再生過程中，TGFβ 通路的激活會促進(jìn)肝組織的再生[7]，但是也有研究顯示TGF-β 通路不利于肝再生[8]。因此，本研究主要分析肝纖維化動物肝部分切除術(shù)后TGF-β 通路對肝功能及肝臟再生的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

SD 大鼠（SPF 級，雄性，6 周齡，210～230 g，北京維通利華動物公司，中國）。四氯化碳（CCl4）（Sigma 公司，美國）。TGF-β抑制劑GW788388（Selleck 公司，中國）。ELISA 試劑盒、HE 染色、Masson 染色試劑盒（碧云天公司，中國）。酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國）。RNAspin Mini （GE Healthcare，美國）。Bestar qPCR RT 和Bestar?qPCR試劑盒（DBI Bioscience 公司，德國）。一抗和山羊抗免疫球蛋白G 二抗（Abcam 公司，美國）。PDVF膜（EMD Millipore， 美 國）。 ECL 顯色試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國）。顯微鏡（Carl Zeiss 公司，德國）。

1.2 肝纖維化建模方法

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]的方法構(gòu)建大鼠肝纖維化模型。將CCl4溶解于橄欖油中，濃度為10%，腹腔注射，每次1 mL/kg，每周2 次，連續(xù)8 周。在行肝部分切除術(shù)時采集肝標(biāo)本通過HE 染色和Masson 染色驗證建模結(jié)果。

1.3 肝切除術(shù)與分組

將32 只肝纖維化模型大鼠進(jìn)行肝切除手術(shù)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，大鼠麻醉后（戊巴比妥、腹膜內(nèi)注射）剃毛消毒，打開腹腔結(jié)扎脾動脈，然后切去肝臟的70%，保留30%左右的右側(cè)肝葉。常規(guī)縫合、抗感染處理。分別在行肝切除術(shù)后第1、3、5、7 天各取8 只大鼠進(jìn)行觀察指標(biāo)的檢測。另8 只大鼠僅打開腹腔暴露肝臟行假手術(shù)作為對照。

1.4 檢測指標(biāo)和方法

1.4.1 HE 染色檢測肝組織損傷 大鼠經(jīng)過斷頭處死，收集肝組織并放置進(jìn)入多聚甲醛固定48 h。將固定好的組織樣本利用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水，然后加入二甲苯進(jìn)行透明處理并包埋至石蠟中，使用切片機切成4 μm 厚的切片。切片水化后制成玻片標(biāo)本，加入蘇木精孵育5 min，然后加入0.5%的伊紅染色5 min，洗滌后透化。固定，在顯微鏡下觀察。

1.4.2 Masson 染色檢測纖維化 將1.4.1 中的玻片標(biāo)本加入Masson 三色染料進(jìn)行染色，根據(jù)試劑盒說明書的方法操作，最后在顯微鏡下觀察并拍照，利用圖IPP 6.0 像分析系統(tǒng)計算膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)。

1.4.3 ELISA 取大鼠尾靜脈血，在300 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心15 min 收集上清液，分別加入抗體和顯色劑，終止顯色反應(yīng)后15 min內(nèi)檢測吸光度（450 nm），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算AST 和ALT 的濃度。

1.4.4 qRT-PCR 使用RNeasy Mini 試劑盒取肝組織中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT 試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37 ℃/15 min；98 ℃/5 min。然后使用Bestar ?qPCR 預(yù)混液進(jìn)行qPCR 實驗，條件如下：95 ℃/2 min，94 ℃/20 s，58 ℃20 s，72 ℃/20 s，40 個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P 序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH 作為內(nèi)參計算mRNA 相對表達(dá)水平。

1.4.5 Western blot 將肝組織裂解后收集總蛋白。通過8%的SDS-PAGE 分離每個樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將5%脫脂牛奶完全浸沒硝酸纖維素膜來封閉非特異性抗原（室溫下2 h）隨后，將膜與分別與一抗（1∶800 稀釋）在4 ℃下孵育過夜，然后將山羊抗兔IgG 二抗按照1∶2 000 的比例稀釋并在室溫下孵育1 h 來進(jìn)行反應(yīng)。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One 軟件分析灰度計算蛋白相對于GAPDH的表達(dá)量。

1.5 動物實驗分析TGF-β在肝再生中作用

將20 只大鼠根據(jù)1.2 的方法構(gòu)建肝纖維化模型。建模后隨機分為2 組：肝部分切除組和肝部分切除+TGF-β 抑制劑組。根據(jù)1.3 的方法，每只大鼠均切除肝臟的70%。肝部分切除+TGF-β 抑制劑組，在術(shù)前2 h 一次性腹膜內(nèi)注射TGF-β 抑制劑GW788388來抑制TGF-β相關(guān)通路，劑量為10 mg/kg[10]。切除后根據(jù)HE 和Masson 染色分析肝纖維化建模結(jié)果，發(fā)現(xiàn)分別有9 只和8 只建模成功，因此分別選擇8 只納入后續(xù)檢測。此外，選擇8 只假手術(shù)大鼠作為對照組。在建模后第5 天，根據(jù)1.4 的方法檢測各組大鼠肝功能指標(biāo)、肝再生情況以及TGF-β/Smad 通路水平。

1.6 免疫組化染色

通過免疫組化染色檢測新生肝組織中Ki-67 蛋白水平評估肝再生能力，檢測LGR5 蛋白評估肝組織中干細(xì)胞水平。多聚甲醛（4%）固定后脫水、包埋、切片（4 μm）。加入3%過氧化氫溶液，室溫靜置20 min，然后加入1∶400 稀釋的Ki-67 抗體在37 ℃孵育60 min；洗滌后加入100 μL 的山羊抗兔IgG 聚合物室溫下孵育50 min；洗滌后加入DAB顯色，然后加入蘇木素染色液孵育20 s，沖洗后顯微鏡觀察，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件隨機選擇5個視野中Ki-67 或者LGR5 陽性細(xì)胞數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0 軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝纖維化建模情況

正常大鼠組肝組織染色均勻，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞排列有序，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)為（0.92±0.08）%。纖維化模型成功后見后，可觀察到肝細(xì)胞膨大，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，并出現(xiàn)嚴(yán)重的出血和炎性浸潤。膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)為（13.52±1.68）%（圖1）。

2.2 肝纖維化大鼠肝部分切除后肝功能指標(biāo)變化

術(shù)后第1 天，大鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT） 和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST） 水平明顯高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。隨著時間的推移，大鼠ALT 和AST 水平均隨之降低（F=145.742，P=0.000；F=119.434，P=0.000）（表1）。

表1 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后ALT和AST變化情況（n=8，± s）Table 1 Changes of ALT and AST in rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

表1 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后ALT和AST變化情況（n=8，± s）Table 1 Changes of ALT and AST in rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）肝部分切除術(shù)后1 d 組比較，P＜0.05Note:1)P＜0.05 vs.sham operation group;2)P＜0.05 vs.post-hepatectomy 1 d group

組別假手術(shù)組ALT（U/L）32.85±4.19 AST（U/L）97.53±8.26部分肝切除組術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后5 d術(shù)后7 d 149.64±16.341）128.87±13.551），2）93.21±9.211），2）71.37±8.061），2）271.34±24.681）234.19±20.511），2）190.31±20.571），2）172.75±18.291），2）

2.3 肝纖維化大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β和Smad mRNA變化

在行肝部分切除后，TGF-β 和Smad mRNA 的水平顯著升高，在第3 天達(dá)到峰值（P＜0.05），而后降低，在第7 天降低至對照組水平（均P＞0.05）（表2）。

表2 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β 和Smad mRNA變化（n=8，± s）Table 2 Changes inTGF-β and Smad mRNA in liver tissues of rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

表2 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β 和Smad mRNA變化（n=8，± s）Table 2 Changes inTGF-β and Smad mRNA in liver tissues of rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05Note:1)P＜0.05 vs.sham operation group

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2.4 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β/Smad通路中蛋白表達(dá)的變化

在行肝部分切除后，TGF-β 和Smad 蛋白的水均明顯升高，在第3 天達(dá)到峰值（P＜0.05），而后降低，在第7 天降低至對照組水平（均P＞0.05）（圖2）（表3）。

表3 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β 和Smad蛋白的變化（n=8，± s）Table 3 Changes in TGF-β and Smad proteins in liver tissues of rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

表3 肝纖維化模型大鼠肝部分切除后肝組織中TGF-β 和Smad蛋白的變化（n=8，± s）Table 3 Changes in TGF-β and Smad proteins in liver tissues of rats with liver fibrosis after partial hepatectomy(n=8,± s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05Note:1)P＜0.05 vs.sham operation group

組別假手術(shù)組TGF-β蛋白0.87±0.08 Smad蛋白0.85±0.09部分肝切除組術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后5 d術(shù)后7 d 1.14±0.111）3.62±0.351）1.43±0.141）0.91±0.09 1.46±0.131）3.47±0.341）1.29±0.121）0.92±0.09

2.5 肝部分切除術(shù)通過TGF-β/Smad通路對肝纖維化大鼠肝功能的影響

3 組大鼠間的肝功能指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝部分切除組的ALT 和AST 水平明顯高于假手術(shù)組，肝部分切除+TGF-β 抑制劑組的ALT和AST 水平明顯高于假手術(shù)和肝部分切除組（均P＜0.05）（表4）。

表4 肝纖維化大鼠肝部分切除術(shù)后肝功能與TGF-β/Smad通路的關(guān)系（n=8，± s）Table 4 The relationship between liver function and TGF-β/Smad pathway in rats with liver fibrosis partial hepatectomy(n=8,± s)

表4 肝纖維化大鼠肝部分切除術(shù)后肝功能與TGF-β/Smad通路的關(guān)系（n=8，± s）Table 4 The relationship between liver function and TGF-β/Smad pathway in rats with liver fibrosis partial hepatectomy(n=8,± s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與肝部分切除組比較，P＜0.05Note:1)P＜0.05 vs.sham operation group;2)P＜0.05 vs.partial hepatectomy group

AST（U/L）95.04±9.24 187.61±17.381）254.83±25.721），2）組別假手術(shù)組肝部分切除組肝部分切除+TGF-β抑制劑組ALT（U/L）32.19±3.95 91.35±9.381）130.64±12.581），2）

2.6 肝部分切除術(shù)通過TGF-β/Smad通路對肝纖維化大鼠肝再生能力及干細(xì)胞水平的影響

3 組大鼠新生肝組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝部分切除組 Ki-67 陽性細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組[ （121.57±8.32） 個vs.（24.63±2.75） 個，P＜0.05]，肝部分切除+TGF-β 抑制劑組的Ki-67 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著低于肝部分切除組[（40.72±3.44）個vs.（121.57±8.32）個，P＜0.05]（圖3A）。3 組大鼠新生肝組織中LGR5 蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝部分切除組LGR5 陽性細(xì)胞數(shù)目明顯高于對照組[（92.43±98.25）個vs.（16.94±1.69）個，P＜0.05]，肝部分切除+TGF-β 抑制劑組的LGR5 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著低于肝部分切除組[（35.87±3.60） 個vs.（92.43±98.25） 個，P＜0.05]（圖3B）。

3 討 論

肝臟疾病發(fā)病率正在逐年上升。病毒性感染，自身免疫性因素，以及多種的藥物等都可引起肝臟不同程度的損傷。與其他器官不同，肝臟是機體唯一一個具有強大再生能力的器官[11-15]。有研究在80 多年前首次證實肝臟在行2/3 切除后可以增生至原體積大小，研究者在不同的嚙齒類動物身上也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象[16-17]。肝纖維化是持續(xù)性和慢性肝損傷的結(jié)果，在肝纖維化過程中，肝細(xì)胞凋亡，內(nèi)皮屏障受損，炎癥細(xì)胞被募集，肝星狀細(xì)胞被激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失調(diào)，最終可能導(dǎo)致肝功能衰竭和肝癌[18-20]。肝切除是治療肝癌的重要方法，但是對于合并肝纖維化的患者，會影響肝臟愈合和再生，研究肝組織再生的機制具有重要的臨床意義。

肝部分切除后會激活肝組織的再生能力，在此過程中，TGF-β/Smad 通路起到重要作用[21]。TGF-β 家族信號通路在細(xì)胞不同的階段起著重要的調(diào)節(jié)作用[22]。包括細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡過程并且從而達(dá)到人體組織器官的穩(wěn)態(tài)。由于TGF-β 功能多樣性和多效性，其通路的放松管制有助于人類疾病的發(fā)生[23-24]。在肝臟中，TGF-β 信號參與疾病進(jìn)展的所有階段，從最初的肝損傷到炎癥和纖維化，到肝硬化和癌癥。TGF-β 對肝細(xì)胞具有細(xì)胞抑制和凋亡作用，在胚胎發(fā)生和生理性肝再生過程中促進(jìn)肝分化[25]。TGF-β 過表達(dá)后或激活Smad 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)肝細(xì)胞增殖[26]。本研究通過腹腔內(nèi)注射CCl4構(gòu)建肝纖維化模型，并切除70%的肝組織，分別在術(shù)后第1、3、5、7 天檢測肝功能，結(jié)果顯示隨著時間的延長，肝功能指標(biāo)AST 和ALT 隨之降低，提示肝功能逐漸恢復(fù)。但是在此過程中，TGF-β 和Smad mRNA 和蛋白水平先升高后降低，并且在建模第3 天達(dá)到峰值。TGF-β/Smad 通路不但具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，還具有促進(jìn)傷口愈合和調(diào)控纖維化的作用。研究顯示機體的各種損傷均會激活TGF-β/Smad 通路，從而調(diào)控膠原蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)的生成，促進(jìn)傷口愈合[27]。但是膠原蛋白的過度累積會影響細(xì)胞活力，影響細(xì)胞增殖甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果提示在肝部分切除術(shù)初期，TGF-β/Smad 的水平升高并參與肝組織愈合，從而促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。但是TGF-β/Smad 通路對肝再生的長期影響還需要進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步驗證肝部分切除術(shù)初期TGF-β/Smad通路參與肝組織的早期修復(fù)保護(hù)肝功能，本研究利用GW788388 來抑制TGF-β 通路。結(jié)果顯示肝部分切除術(shù)后，肝功能指標(biāo)AST 和ALT 升高，肝組織中增殖蛋白Ki-67 和干細(xì)胞指標(biāo)LGR5 均顯著升高。而當(dāng)使用GW788388 抑制TGF-β 通路后，肝功能指標(biāo)AST 和ALT 升高進(jìn)一步升高，而Ki-67 和LGR5 陽性的細(xì)胞數(shù)目被顯著抑制。TGF-β/Smad 是促進(jìn)細(xì)胞增殖的重要通路，Smad 可提高Ki-67 基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而提高Ki-67 蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖[28]。并且Ki-67 的水平也是評估肝再生的關(guān)鍵蛋白[15]。LGR5 是一種孤兒受體蛋白，是消化系統(tǒng)組織中的干細(xì)胞的標(biāo)志物，研究顯示肝組織中LGR5 陽性的細(xì)胞會提高肝細(xì)胞的自我更新能力[16]。并且LGR5陽性肝細(xì)胞也可以緩解肝纖維化減少肝細(xì)胞損傷[17]。而LGR5 的 表達(dá) 受 到TGF-β/Smad 通路 的 調(diào)控，研究顯示TGF-β/Smad 能夠通過促進(jìn)LGR5 的表達(dá)提高胃癌細(xì)胞增殖能力[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)TGFβ/Smad 通路的激活能夠提高LGR5 蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性[29]。有研究[30]顯示肝部分切除后TGF-β/Smad 通路賦予肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞特征，這提示肝纖維化大鼠在進(jìn)行肝部分切除術(shù)后，TGF-β/Smad 通路相關(guān)蛋白表達(dá)會上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)Ki-67 和LGR5 蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，并提高干細(xì)胞水平，進(jìn)一步增殖和分化為肝細(xì)胞，促進(jìn)肝臟再生和肝組織修復(fù)。

綜上所述，本研究結(jié)果初步揭示了肝部分切除術(shù)能夠通過調(diào)控TGF-β/Smad 信號通路促進(jìn)肝纖維化大鼠模型術(shù)后7 d 內(nèi)的肝再生，可能為肝臟纖維化治療提供一個新的治療思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。