董文超，昝強(qiáng)，馬建兵，卿忠，支力強(qiáng)*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，陜西 咸陽 712000；3.西安市紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 西安 710054)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療晚期關(guān)節(jié)病變的有效方法，而關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染，又稱關(guān)節(jié)假體周圍感染(prosthetic joint infection，PJI)，是關(guān)節(jié)置換術(shù)后災(zāi)難性的并發(fā)癥[1]，給患者造成了沉重的負(fù)擔(dān)，且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。文獻(xiàn)報(bào)道初次膝、髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI發(fā)生率為0.7%～2.0%[3-4]，而翻修術(shù)后PJI發(fā)生率5.6%～35.0%[5-7]，并且這個(gè)數(shù)據(jù)隨著國(guó)內(nèi)老齡化的發(fā)展，人工關(guān)節(jié)置換患者基數(shù)的增長(zhǎng)也在不斷增大[8]。而PJI屬于外科手術(shù)植入物的相關(guān)感染，常需進(jìn)行再次手術(shù)和較長(zhǎng)時(shí)間的抗生素治療，明顯增加患者的治療費(fèi)用及住院時(shí)間，嚴(yán)重影響療效及患者的滿意度[9]。PJI發(fā)生后如果能做到早期診斷并明確病原菌，大部分病例可獲得較好的療效，但延誤診斷和無法及時(shí)針對(duì)性治療，常會(huì)導(dǎo)致患者需要承受多次手術(shù)，接受多種抗生素治療，更多的治療花費(fèi)，嚴(yán)重者甚至需要截肢手術(shù)甚至死亡[10-13]。因此，及時(shí)和準(zhǔn)確的微生物診斷能有效指導(dǎo)醫(yī)生選擇合理的抗生素和處理方法，提高PJI的治愈率，才是PJI治療成功的關(guān)鍵。

現(xiàn)今在術(shù)前診斷PJI時(shí)仍存在許多困難，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)是PJI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一[14]。但結(jié)合以往研究及文獻(xiàn)報(bào)道提示，傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)病原的檢出率常不超過50%[15-16]，可能的原因包括：慢性PJI的致病微生物被假體表面生物膜包裹；關(guān)節(jié)液和滑膜組織中的浮游菌量低；生物膜誘導(dǎo)微生物進(jìn)入休眠狀態(tài)，難以培養(yǎng)；部分微生物培養(yǎng)條件苛刻，常規(guī)培養(yǎng)困難；取材前應(yīng)用抗生素，微生物生長(zhǎng)受抑制等[17-18]。近年來宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)不斷發(fā)展并在臨床診斷領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[19]。mNGS技術(shù)將高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，直接檢測(cè)樣本中的所有核酸，并將結(jié)果與對(duì)準(zhǔn)工具進(jìn)行比較，以確定樣本中所有已知微生物的種類和豐度[20]。與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，mNGS不僅能夠明顯提高PJI患者的病原菌檢出率，檢出與細(xì)菌培養(yǎng)一致的病原菌，而且可以檢出多種其他潛在的病原菌，檢測(cè)耗時(shí)短，更有利于PJI的早期診斷和及時(shí)治療，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

由于mNGS技術(shù)在臨床上并未普遍應(yīng)用于PJI的診斷，關(guān)于其在PJI診斷的應(yīng)用也鮮有報(bào)道，在PJI的診治作用尚未明確。因此，本研究的目的是通過評(píng)估m(xù)NGS對(duì)關(guān)節(jié)液或滑膜組織中感染微生物的敏感性和特異性等診斷性能指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)在mNGS指導(dǎo)下靶向用藥治療所需的治療時(shí)間、花費(fèi)及使用抗生素后可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)等，將其結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比來確定該技術(shù)在對(duì)PJI的診斷性能和治療花費(fèi)及時(shí)效性上是否具有差異。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 2019年1月至2021年1月西安市紅會(huì)醫(yī)院關(guān)節(jié)科收治的進(jìn)行了關(guān)節(jié)翻修術(shù)疑似膝關(guān)節(jié)或髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI和無菌性松動(dòng)(aseptic loosening，AL)的患者進(jìn)行了篩查。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)患者年齡>18歲；(2)既往行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(total knee arthroplasty，TKA)或全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(total hip arthroplasty，THA)失敗需要二次翻修患者；(3)參考2018年費(fèi)城共識(shí)對(duì)于PJI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]分為PJI或AL；(4)簽署手術(shù)及研究知情同意書；(5)收集到足夠的關(guān)節(jié)液或滑膜組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料或檢查不足以明確是否為PJI或AL；(2)用于mNGS檢測(cè)的關(guān)節(jié)液或滑膜組織量過少；(3)采樣、轉(zhuǎn)運(yùn)或處理標(biāo)本的過程中明顯污染，以及可能影響實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果的炎癥性疾病或惡性腫瘤的患者；(4)提取DNA濃度量過低無法建立測(cè)序文庫(kù)，或者建庫(kù)后量過低無法上機(jī)測(cè)試。

1.2 一般資料及分組情況 60例患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，38例膝關(guān)節(jié)及22例髖關(guān)節(jié)。PJI組42例，男16例，女26例；年齡29～82歲，平均(64.33±13.03)歲；AL組18例，男6例，女12例；年齡44～85歲，平均(62.50±9.78)歲。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.801)；PJI患者術(shù)前關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及紅細(xì)胞沉降率指標(biāo)均明顯高于AL組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組中性粒細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.114，見表1)。進(jìn)一步選取于2017年1月至2018年12月僅行常規(guī)培養(yǎng)陰性的PJI患者20例，作為經(jīng)驗(yàn)性抗生素組(empirical antibiotic group，EA)；2019年1月至2021年1月行mNGS檢測(cè)的20例PJI患者作為靶向抗生素組(targeted antibiotic group，TA)。對(duì)兩組患者進(jìn)行至少6個(gè)月的隨訪，統(tǒng)計(jì)分析兩組在抗生素使用時(shí)間、住院抗生素花費(fèi)、不良反應(yīng)例數(shù)及復(fù)發(fā)病例的差異。不良反應(yīng)主要包括肝功能損害(谷丙轉(zhuǎn)氨酶或谷草轉(zhuǎn)氨酶峰值>1.5倍正常上限值)、腎功能損害(血清肌酐值>1.5倍初始值)及藥疹(排除其他原因，全身或局部皮疹)。

表1 PJI與AL組患者術(shù)前一般資料比較

1.2 關(guān)節(jié)液或假體周圍組織標(biāo)本采集及微生物培養(yǎng) 術(shù)前收集關(guān)節(jié)液、術(shù)中收集關(guān)節(jié)液或滑膜組織分別送常規(guī)培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)，測(cè)序組將采集的關(guān)節(jié)液或滑膜組織置入一次性容器內(nèi)，樣本容器應(yīng)密閉、無菌、無核酸酶及其他擴(kuò)增抑制物并立即送至測(cè)序機(jī)構(gòu)。對(duì)未能及時(shí)送達(dá)的標(biāo)本于-80 ℃冰箱保存，待第2天送檢。余下的關(guān)節(jié)液或滑膜組織在室溫下15min內(nèi)送至微生物室微生物培養(yǎng)。選用illumina Next Seq 550Dx測(cè)序儀平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，之后使用PACE seq檢測(cè)進(jìn)行生物信息學(xué)對(duì)比分析，對(duì)微生物進(jìn)行鑒定，具體測(cè)序流程見圖1。

圖1 mNGS測(cè)序?qū)嶒?yàn)及序列分析流程

與測(cè)序機(jī)構(gòu)合作提出置信度指標(biāo)，置信度為“高”，建議臨床重點(diǎn)關(guān)注。置信度為“中”的微生物可能來自于采樣環(huán)節(jié)、定植微生物或環(huán)境微生物，需要結(jié)合臨床進(jìn)行判讀，如有必要請(qǐng)后續(xù)再次送樣進(jìn)行檢測(cè)。該指標(biāo)通過樣本測(cè)序量、檢出序列數(shù)、微生物基因組大小、覆蓋度、質(zhì)控情況等多個(gè)維度綜合分析得出，體現(xiàn)了該微生物為致病菌的可能性。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)結(jié)果 42例PJI患者的細(xì)菌培養(yǎng)中30例為陽性，mNGS檢測(cè)有40例陽性；18例AL患者的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果2例為陽性，mNGS檢測(cè)有7例結(jié)果為陽性。細(xì)菌培養(yǎng)共檢出12種病原菌，mNGS檢測(cè)共檢出31種病原菌。占比數(shù)最高的兩種病原菌分別為表皮葡萄球菌(22%)及金黃色葡萄球菌(12%)，檢測(cè)結(jié)果包括2例真核微生物黃曲霉和7例病毒(見圖2)。PJI組30例細(xì)菌培養(yǎng)陽性的患者中，29例mNGS檢測(cè)陽性；其中16例與培養(yǎng)結(jié)果在種屬水平完全一致，3例與培養(yǎng)結(jié)果完全不一致，1例在屬水平一致，9例mNGS檢測(cè)出和微生物培養(yǎng)結(jié)果一致外的更多病原菌。

圖2 mNGS病原菌檢測(cè)結(jié)果

2.2 實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)針對(duì)關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI診斷效率比較 將2018年費(fèi)城共識(shí)中PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”來計(jì)算傳統(tǒng)培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及一致率。結(jié)果顯示mNGS組敏感度明顯大于培養(yǎng)組；mNGS組特異度61.1%低于培養(yǎng)組94.4%，mNGS的一致率85.0%大于培養(yǎng)組的60.0%；mNGS的檢出時(shí)間(1.87±0.39)d明顯低于培養(yǎng)組的(5.55±0.65)d，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值的兩組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)和mNGS檢測(cè)對(duì)關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI的診斷效率

2.3 EA組和TA組抗生素使用及經(jīng)濟(jì)學(xué)比較 20例TA組PJI患者在靜脈抗生素使用時(shí)間為(10.15±1.50)d，對(duì)照組EA組靜脈抗生素使用時(shí)間為(14.52±2.00)d；TA組住院治療間抗生素費(fèi)用為(6 149.15±763.06)元，對(duì)照組EA組的住院抗生素治療費(fèi)用為(10 874.70±1 353.63)元，兩組在靜脈抗生素使用時(shí)間及住院間抗生素治療花費(fèi)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TA組出現(xiàn)1例肝功能損害；EA組出現(xiàn)7例不良反應(yīng)，包括4例肝功能損害、2例腎功能損害和1例藥疹。兩組在使用抗生素發(fā)生不良反應(yīng)的差異上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044)；隨訪1年EA組2例感染復(fù)發(fā)，TA組無一例感染復(fù)發(fā)。

2.4 mNGS耐藥基因及藥敏名單與對(duì)比 對(duì)于置信度為“高”且達(dá)到一定的覆蓋度的結(jié)果，嘗試根據(jù)CARD(comprehensive antibiotic resistance database)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行耐藥基因預(yù)測(cè)報(bào)告8例，mNGS結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果相符率可達(dá)87.5%(7/8)。證明mNGS結(jié)果可以指導(dǎo)臨床用藥，通過早期針對(duì)性用藥有效抑制病原菌繁雜，減少抗生素使用時(shí)間，達(dá)到減輕病患痛苦、減少治療花費(fèi)的目的。部分置信度為“高”患者的耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果見表3。

表3 患者的耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討 論

PJI是關(guān)節(jié)置換術(shù)后的一種災(zāi)難性并發(fā)癥，其診斷及治療仍存在許多挑戰(zhàn)。無論選擇何種治療方式，關(guān)鍵是需要明確病原菌。病原菌不能明確難以有針對(duì)性的選擇抗生素，治療效果往往不理想，且容易產(chǎn)生耐藥性，延誤治療，甚至引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。而準(zhǔn)確識(shí)別關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI中的感染病原菌，可以提高感染控制率[12，22-23]。文獻(xiàn)資料報(bào)道[24-25]傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)敏感性較低，在關(guān)節(jié)置換術(shù)后PJI病原菌的檢測(cè)能力上有所不足，難以找到致病菌，影響抗生素的使用；在檢測(cè)時(shí)間上偏長(zhǎng)，不能早期針對(duì)性使用抗生素治療，會(huì)進(jìn)一步增加患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

近年來mNGS技術(shù)被嘗試性的試用于臨床感染患者的病原菌診斷，有研究表明，mNGS技術(shù)提高了口腔感染、顱內(nèi)感染和肺部感染等傳染病致病微生物的檢測(cè)率[26]。有一些關(guān)于使用mNGS進(jìn)行PJI診斷的報(bào)道，其結(jié)果顯示出良好的敏感性和特異性[27]，同時(shí)mNGS可以檢測(cè)到滑液培養(yǎng)鑒定的大多數(shù)病原菌(物種水平82.9%，屬水平90.2%)以及一些未經(jīng)培養(yǎng)鑒定的病原菌。Street等[28]還證明，mNGS的物種級(jí)敏感性為88%(95%可信區(qū)間，77%～94%)，屬級(jí)敏感性為93%(95%可信區(qū)間，84%～98%)，物種級(jí)特異性為88%(95%可信區(qū)間，79%～93%)。此外，一些微生物如唾液酸支原體，不能通過常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)，可以通過mNGS精確地識(shí)別出來[29]。與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)相比，mNGS不僅能夠明顯提高PJI患者的病原菌檢出率，檢出與細(xì)菌培養(yǎng)一致的病原菌，而且可以檢出多種其他潛在的病原菌。檢測(cè)耗時(shí)短，更有利于PJI的早期診斷和及時(shí)治療，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

本研究共納入60例患者(42例PJI，18例AL)，有32例患者微生物培養(yǎng)結(jié)果呈陽性，敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和一致率分別為71.4%、94.4%、93.8%、33.3%和60.0%。47例患者的mNGS結(jié)果呈陽性，敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和一致率分別為95.2%、61.1%、85.1%、84.6%和85.0%。研究表明，術(shù)中收集的關(guān)節(jié)液和滑膜組織mNGS的敏感性優(yōu)于微生物培養(yǎng)，7例初次診斷為AL的患者關(guān)節(jié)液或滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了病原菌，結(jié)果可能與關(guān)節(jié)中存在慢性微生物的定植有關(guān)，費(fèi)城共識(shí)中指出關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者關(guān)節(jié)內(nèi)存在慢性持續(xù)的定植。事實(shí)上，這是來自皮膚且可形成生物膜的無害(低毒力)微生物所造成感染的基本特征[30]。關(guān)于原生關(guān)節(jié)在何種程度上也存在這些微生物群的資料相當(dāng)有限，一些針對(duì)明顯未感染個(gè)體關(guān)節(jié)液的微生物學(xué)研究為這一假設(shè)提供了支持性證據(jù)。此外，一些研究通過細(xì)菌培養(yǎng)或嚴(yán)格的分子技術(shù)從肩關(guān)節(jié)液中鑒定出細(xì)菌[31-33]。研究結(jié)果說明，mNGS檢測(cè)具有強(qiáng)于微生物培養(yǎng)的病原菌識(shí)別能力，這有助于我們排除一些假陰性患者，幫助臨床精確診斷、減少誤診。在病原菌的檢出所需時(shí)間上，mNGS相較于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)也更具優(yōu)勢(shì)，mNGS組(1.87±0.39)d明顯低于培養(yǎng)組的(5.55±0.65)d，這使我們可以盡早根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果針對(duì)性的進(jìn)行治療，有利于PJI的早期診斷和及時(shí)的治療。

PJI造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也是值得關(guān)注的問題，患病率和住院費(fèi)用也呈上升趨勢(shì)[34]。因此，仔細(xì)和持續(xù)地監(jiān)測(cè)這些趨勢(shì)及其相關(guān)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是至關(guān)重要的。由于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度較低，在治療上往往會(huì)經(jīng)驗(yàn)性的對(duì)這些PJI患者使用抗生素，從治療效果和時(shí)間上無法與明確病原菌針對(duì)性用藥相比。本研究中對(duì)兩組40例患者的治療時(shí)間和花費(fèi)進(jìn)行了研究，EA組患者在抗生素的使用時(shí)間上(14.52±2.00)d明顯長(zhǎng)于TA組的(10.15±1.50)d，EA組在治療過程中產(chǎn)生了多于TA組的抗生素花費(fèi)，并且EA組報(bào)道了7例不良反應(yīng)多于TA組的1例，這可能與EA組難以準(zhǔn)確針對(duì)致病菌使用抗生素有關(guān)。本研究探索性地提供耐藥基因檢測(cè)報(bào)告為臨床抗生素使用提供指導(dǎo)，通過判讀部分置信度為“高”，達(dá)到一定的覆蓋度的耐藥基因預(yù)測(cè)報(bào)告，得到mNGS結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果相符率可達(dá)87.5%。雖然基因型并不等于表達(dá)，測(cè)到耐藥基因不代表一定耐藥，但這對(duì)臨床早期正確選擇抗生素，避免因抗生素耐藥而延誤PJI患者的治療仍具有一定指導(dǎo)意義。

本研究仍存在一些不足，如本研究是一個(gè)樣本量相對(duì)較小的單一中心研究(PJI組42例患者，AL組18名患者)，有必要進(jìn)行具有大量樣本的多中心研究；選擇2018年制定的新PJI診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)[21]，也可能造成個(gè)別病例的分組錯(cuò)誤，mNGS檢測(cè)結(jié)果需要的read數(shù)較高，否則檢出靈敏度低容易導(dǎo)致假陰性。此外，mNGS也對(duì)污染高度敏感，因此對(duì)mNGS檢測(cè)呈陽性結(jié)果，尤其是對(duì)于微生物培養(yǎng)陰性的PJI，應(yīng)考慮患者的病史和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果?？傊琺NGS可以有效地識(shí)別PJI患者的病原菌，特別是在那些傳統(tǒng)培養(yǎng)難以檢出的病原菌或最近使用抗生素引起的陰性培養(yǎng)的情況下。mNGS表現(xiàn)出比傳統(tǒng)培養(yǎng)更高的靈敏度，其在PJI的診斷中具有更大的診斷價(jià)值。本研究結(jié)果認(rèn)為應(yīng)在臨床中將mNGS與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)結(jié)果結(jié)合判讀，這對(duì)于幫助臨床診斷PJI致病菌具有重大意義。