陳婷婷，張 燕，程會賢，陳名園，王 巍

(四川大學華西第二醫(yī)院病理科、出生缺陷與相關婦兒疾病教育部重點實驗室，四川 成都，610044)

宮頸癌是全球女性的第四大常見癌癥類型[1]，在中國僅次于乳腺癌，為女性第二大常見癌癥類型。在15～44歲女性各系統(tǒng)癌癥發(fā)病率中居第二位，死亡率居第三位，且近年來呈年輕化趨勢[2]。高危型人乳頭瘤病毒( human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染是公認的導致宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical epithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌的主要致病因素。作為目前唯一病因明確的癌癥，宮頸癌是可以通過早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)、徹底防治的[3]。但目前全球宮頸癌防控形勢仍然非常嚴峻，特別是在中低收入國家。目前，越來越多的國家開始使用HPV基因分型進行宮頸癌初篩。不同HPV亞型擁有不同的致癌能力，了解不同亞型在宮頸病變中的分布及多重感染情況對宮頸癌的預防、疫苗應用及篩查策略制定，均有著重要意義。本研究選取四川大學華西第二醫(yī)院病理科診斷為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌的四川地區(qū)病例，運用返向點雜交法檢查其HPV感染情況，統(tǒng)計不同亞型HPV在CIN及宮頸癌中的分布及多重感染情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年7月至2020年6月四川大學華西第二醫(yī)院病理科診斷為CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌的四川地區(qū)病例384例，其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ分別為77、50、166例，宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma，SCC)91例。均符合WHO2020版《女性生殖道病理學》診斷標準，并為經(jīng)組織病理診斷明確的四川地區(qū)病例。排除資料不全病例。

1.2 方法

1.2.1 組織學檢查所有病例組織學結果均經(jīng)2名高級職稱病理醫(yī)師復查，結果分為低級別上皮內(nèi)瘤變CINⅠ、高級別上皮內(nèi)瘤變CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌四組，同時具有多種病變者，以最嚴重病變歸入相應組。

1.2.2 HPV亞型檢測①儀器與試劑：基因擴增儀ETC-811購自于蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司，全自動核酸分子雜交儀YN-H48和人乳頭瘤病毒基因分型(23型)檢測試劑盒(PCR-返向點雜交法)均購自于亞能生物科技(深圳)有限公司。②實驗步驟：采用HPV基因分型檢測試劑盒(亞能生物)進行HPV檢測，經(jīng)過樣本HPV DNA的提取，PCR擴增，雜交，洗膜，顯色，對所有病例進行23種HPV亞型檢測，包括17種高危型HPV(HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82) 和6種低危型HPV( HPV6、11、42、43、81、83)。③結果判斷(參照產(chǎn)品說明書)：僅一個基因型位點出現(xiàn)藍色斑點，則為相應基因型的單一感染；多個基因型位點出現(xiàn)藍色斑點，則為相應基因型的混合多重感染。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組病變年齡及HPV感染率所有患者(384例)平均年齡(43.45±10.73)歲，各組病變平均年齡逐漸增大。384例患者總的HPV感染率為95.80%，其中高危型感染率95.05%，低危型感染率7.81%。各組病變均以高危型HPV感染為主，且高危型HPV感染率與總體HPV感染率比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 HPV亞型分布情況368例感染病例中，共檢出病毒493株，23種亞型均有檢出。低危型HPV感染占比(6.29%)遠低于高危型占比(93.71%)。CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ及宮頸癌中高危型感染占比逐漸升高，而低危型HPV感染占比逐漸降低，趨勢檢驗結果說明低、高危型的病毒感染與病變程度之間存在線性變化(Z=9.085，P=0.003)。不同宮頸病變組別間低危型和高危型HPV感染構成比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)，以高危型HPV感染為主。見表2。

表1 宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中各組病變年齡及HPV感染情況

表2 宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中低危型和高危型HPV分布情況[株(%)]

總體病例中最常見的HPV類型為16、58、52、33、18型；其中CINⅠ中最常見感染類型為HPV52、58、56、51、68、16及6型；CINⅡ中最常見的為HPV52、16、58及51型；CINⅢ中最常見的為HPV16、58、33、52及31型；宮頸癌中最常見的為HPV16、18、58、33及52型。HPV16型在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中感染率逐漸增高(從9.09%到71.43%)。此外，HPV16、18、58、52、33五種亞型在宮頸癌中感染率高達96.70%，其中16型71.43%，18型7.69%，而52、58、33三種類型為17.58%。見表3。

表3 宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中不同HPV亞型分布情況 [n(%)]

2.3 HPV多重感染情況368例感染病例中單一亞型感染274例(74.46%)，多重感染94例(25.54%)。在多重感染中，雙重感染69例(18.75%)，三重及以上感染25例(6.79%)；低危+高危感染27例(7.34%)，多重高危感染67例(18.20%)。HPV多重感染在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中占比分別為50.00%、30.61%、21.25%、10.34%。統(tǒng)計結果顯示，不同宮頸病變組間單一亞型、多重感染構成比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，以單一亞型HPV感染為主。見表4。

表4 宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中HPV單一亞型感染和多重感染情況

3 討論

3.1 各級CIN的發(fā)病年齡及HPV感染情況HPV是一種雙鏈DNA、無包膜病毒，定向感染皮膚及黏膜的復層鱗狀上皮細胞[3]。高危型HPV持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要因素，幾乎所有的宮頸鱗狀細胞癌都與HPV感染相關。既往觀點認為，HPV感染導致CIN病變是一個緩慢、漸進和連續(xù)的過程，低級別CIN(CINI)發(fā)展到高級別CIN(CINⅡ和CINⅢ)直至惡變?yōu)閷m頸癌需要數(shù)年至數(shù)十年時間[3, 4]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，患者年齡是隨著病變嚴重程度增加而增高的，從CINⅠ發(fā)展到CINⅢ直至宮頸癌大致需要十年時間，這與既往文獻報道基本一致。但是，我們也發(fā)現(xiàn)部分年輕CIN患者沒有低級別CIN病變，而發(fā)病直接就是高級別CIN病變。這一發(fā)現(xiàn)也在Bedell等的文獻中得到了證實[5]，該文獻還指出不是所有的高級別CIN都是由低級別CIN發(fā)展而來，CINⅠ可能不是CINⅢ發(fā)展的必要條件，有些CINⅢ可以直接從HPV感染的正常上皮細胞進化而來。這種發(fā)病機制可能與我們已知的HPV致癌機制不同，可能是由某些基因的甲基化程度所決定，導致的病變不是由量變到質(zhì)變的線性發(fā)展，而是類似“分子開關”模型(全或無)，進展為宮頸癌所需時間也更短。

3.2 宮頸各級CIN病變中HPV各基因亞型分布情況HPV各基因亞型的分布和頻率在不同地區(qū)及不同病變中均存在差異。一項集中全世界各國一萬多例宮頸癌患者薈萃分析研究發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)最常見的基因型是HPV16型，第二位為HPV18型，其他基因型如HPV58、52型在亞洲較多[6]。本研究結果與以上結論相符，宮頸癌中最常見的HPV基因型為16、18、58、33、52。此五種高危型HPV在宮頸癌中感染率高達96.70%，其中16、18型高達79.12%，而52、58、33三個亞型占比也達17.58%。各病變組中常見HPV感染亞型均不完全相同且存在變化，且有別于國內(nèi)其他地區(qū)HPV分布研究。劉鍵等[7]深圳地區(qū)研究中常見HPV類型為16、18、58、31、33；張勤等[8]重慶地區(qū)研究中常見HPV類型為16、18、33、52、58；而本研究中常見HPV類型為16、58、52、33、18。相似之處為16型最常見，52、58、33型也均較常見，不同之處為四川地區(qū)18型陽性比率低于前兩研究。其原因除了地域差異外，研究對象的納入標準不同也會導致結果不同。馮余寬等[9]四川地區(qū)常見HPV類型為58、16、56、18。范永霞等[10]成都地區(qū)常見HPV類型為52、16、53、58、51。其結果不同于本研究是由于前者納入了大量宮頸炎病變患者，而后者是分析的液基細胞樣本。四川地區(qū)HPV感染有一定地域性特點，但也要考慮其他研究因素對結果的影響(比如其他研究的對象可能是婦科門診患者或者包含宮頸炎患者，而我們的研究對象是CIN及宮頸癌患者)。HPV基因亞型在不同宮頸病變中的分布和頻率存在變化規(guī)律，高危型HPV(主要是16亞型)感染率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宮頸癌中逐漸升高。2015年美國陰道鏡和宮頸病理學會(ASCCP)發(fā)布并執(zhí)行了FDA批準的HPV檢測用于宮頸癌初步篩查的臨時指南[5]，并將HPV16、18作為篩查分流的依據(jù)。相比細胞學篩查，HPV篩查結果更客觀且有更高的陰性預測值。但我國HPV感染除常見的16、18型外，58、52、33陽性占比也較高，且均可單獨導致宮頸癌的發(fā)生[6, 9]。由此可以推測，在我國四川地區(qū)，四價疫苗和九價疫苗的有效保護率會高于文獻報道[11]的70%和90%。在沒有接種九價HPV疫苗患者中，除16、18型外，58、52、33型感染更值得關注。

3.3 HPV多重感染情況現(xiàn)有的大量研究均表明，患者的年齡、性行為、伴侶人數(shù)、環(huán)境條件、吸煙等多種因素是導致HPV感染的主要原因，而上述一些因素如擁有不同的性伴侶則可導致多重感染的發(fā)生[9, 12, 13]。而多重感染各亞型HPV是否存在相互作用，尤其是高危型HPV多重感染對宮頸CIN病變以及宮頸癌的發(fā)生是否會有協(xié)同作用這一問題則鮮見有研究。為了探索HPV多重感染尤其是高危型HPV多重感染是否會加重CIN病變、是否會比單一亞型感染更加容易致癌，本文對各級別CIN及宮頸癌的多重HPV感染情況進行了研究。可以發(fā)現(xiàn)，CINⅠ、CINⅡ、CIN Ⅲ及宮頸癌中多重感染率從50.00%到10.34%明顯是逐漸減低的。這一結果至少說明了兩點： ①HPV多重感染率沒有隨著病變嚴重程度增加而增高，相反是降低的，因此可以認為HPV多重感染對病變的發(fā)展并沒有協(xié)同促進作用；②從多重感染的亞型分布來看，隨著病變加重、HPV多重感染率下降，漸少的亞型主要是低危型HPV，而高危型HPV也有不同程度的減少，由此可見絕大多數(shù)HPV感染是一過性的。對于第一點，Chaturvedi等[14]也通過對5871名性活躍婦女HPV感染情況研究發(fā)現(xiàn)，多重感染患宮頸癌風險與單一感染總體相似，幾乎沒有多重感染的HPV之間存在協(xié)同相互作用的證據(jù)，多重感染中的HPV是隨機發(fā)生并獨立導致宮頸疾病。VanHoof等[15]通過激光捕獲顯微切割-HPV PCR基因分型(LCM-PCR)技術，從CIN和正常上皮切片中的各個不同病變區(qū)域的上皮細胞中準確地檢測出特定類型的HPV DNA。通過LCM-PCR發(fā)現(xiàn)，在93%的病變區(qū)域中每一種HPV類型均只與一種獨立的CIN病變相關，而在7%多重感染病變區(qū)域中，也大部分是由兩個獨立的CIN病變碰撞產(chǎn)生。由此作者也總結出，一種HPV感染一個獨立的宮頸上皮區(qū)域，引起一種獨立的病變(CINⅠ、CINⅡ或CINⅢ)。對于第二點，其原因一方面可能是低危型HPV DNA在感染中多以游離形式存在，宿主免疫系統(tǒng)可將其清除；而高危型HPV DNA最初也以游離形成存在，但隨著持續(xù)性感染，病毒可將其部分DNA片段(包括E6/E7 DNA)整合入宿主DNA，導致原癌基因被激活。到這個時候宿主免疫系統(tǒng)就無法將其完全清除，進而進展為高級別上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌[3, 16, 17]。而另一方面正如VanHoof等的研究結果提示，一種HPV感染引起一種獨立的病變，病變獨立且具有排它性即HPV間可能存在競爭性抑制效應[15]。當然，這還需要更多的科學研究來證實。綜上所述，結合近來最新的研究和我們的臨床研究結果，我們認為HPV多重感染并未增加癌的風險，當然不同HPV亞型感染之間的相互關系與作用，值得我們深入研究。