寇涂利 ，尹立雪,，羅浩柔 ，沈 陽

(1.西南醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院,四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院.四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科,四川 成都 610072；3.成都市第七人民醫(yī)院,四川 成都 610000)

心肌肥厚作為一種心臟超負荷的代償性反應，和許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[1]，心肌肥厚最初是維持正常血液循環(huán)的代償機制，但持續(xù)的肥厚不僅能刺激膠原合成，促進間質纖維化，并且還能誘導基質金屬蛋白酶(MMPs)活化，從而降解膠原，最終會導致充血性心力衰竭和猝死[2]。心肌肥厚是導致心力衰竭和猝死的主要原因之一，因此，阻斷心肌肥厚是防治心臟重構、改善心肌功能的關鍵環(huán)節(jié)[3]。有研究表明，某些植物化學物質可以通過調節(jié)信號傳導通路從而抑制病理性心肌肥厚，主要包括蛋白激酶C(PKC)通路、鈣調神經(jīng)磷酸酶(CaN)通路和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)通路等[4]。作為被廣泛研究的中草藥，鹽酸小檗堿已被證明具有多種藥理作用，如免疫調節(jié)、抗炎、抗腫瘤、降血脂等[5]。有研究稱其能有效抑制病理性肥厚，然而其作用機制尚不明確[6]。本研究于2021年4～9月采用異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚模型，擬觀察鹽酸小檗堿對Rho/ROCK信號通路的影響及其抗心肌肥厚的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SD大鼠(230～270克)，SPF級，購于成都達碩實驗動物公司(SCXK 2020-030)。大鼠在恒溫條件下適應性喂養(yǎng)一周，自由飲食和飲水。本工作獲得四川省人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試劑及器材ISO(貨號：HY-B0468)、蘇木素染液(批號：ZH193907)均購自武漢塞維爾生物科技有限公司。伊紅染液(批號：C200403)購自珠海貝索生物技術有限公司。改良Masson三色染色液(批號：0227A21)購自合肥博美生物科技有限責任公司。ROCK(批號：AF7016)、 RchoA(批號：AF6352)、PTEN(批號:AB31392)，均購自北京博奧森生物技術有限公司。TGFβ1(批號:BS-20411R)抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。生物素二抗：山羊抗兔工作液(批號：SP-9001)，購自北京中杉金橋生物有限公司。心臟超聲儀器(Vivid E9)美國GE公司。圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗動物與分組 將40只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、較低劑量干預組、較高劑量干預組，每組10只。大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，除了正常組對照以外，其余組大鼠予以腹腔注射3 mg/kg異丙腎上腺素建立心肌肥厚模型，正常對照組給予等量生理鹽水7天。建模后12小時，分別予以較低劑量干預組、較高劑量干預組大鼠5、10 mg/kg鹽酸小檗堿灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。

1.3.2超聲數(shù)據(jù)采集 所有大鼠的超聲圖像在基線時、成功建模后和給藥后2周后收集。將大鼠置于左側臥位并固定在檢查床上，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。連接同步肢體導聯(lián)心電圖獲得超聲參數(shù)。使用12 S(12 MHz)相控陣兒科換能器,頻率為10 MHz，深度為2 cm，幀率為每秒220幀。在乳頭肌水平獲得的標準二維短軸圖像被數(shù)字化存儲。記錄舒張末期心室間隔(IVS)厚度、左心室后壁厚度(LVPW)，所有參數(shù)測量3次，取平均值。

1.3.3病理學觀察 圖像采集后，每組分別隨機處死3只大鼠。左心室心肌用10%多聚甲醛固定，切片用蘇木精和伊紅染色，觀察心肌細胞的形態(tài)和壞死程度；Masson三色染色觀察心肌纖維化程度。每個切片隨機選取5個視野，在光學顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4各組大鼠心肌組織Rho/ROCK信號通路因子表達量 采用免疫組織化學SP法檢測 RhoA、ROCK、TGF-β1、P-PTEN蛋白表達情況。 固定標本、包埋、切片，使用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化以及3%甲醇雙氧水滅活后行抗原修復。 一抗4 ℃孵育12 h后滴加二抗,然后使用DAB顯色試劑盒，混勻試劑后滴加到切片上，室溫顯色。用顯微鏡對切片進行圖像采集,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的光密度(integrated optical density，IOD)和面積，并計算每張圖像的平均光密度(Mean density，MD)，以平均來評價蛋白表達情況。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。四組大鼠建模前后、干預前后采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況實驗中，正常對照組大鼠未見明顯異常；在建立給予腹腔注射異丙腎上腺素期間，模型組大鼠、較低劑量干預組、較高劑量干預組分別猝死2只、1只、1只，最終總共36只大鼠被納入統(tǒng)計分析。

2.2 常規(guī)超聲數(shù)據(jù)四組大鼠基線IVS、LVPW值比較，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在整個實驗過程中，正常對照組大鼠的IVS、LVPW值無明顯變化(P>0.05)。其余組大鼠的IVS、LVPW值在模型建立后顯著增加(均P< 0.05)。在相應干預后，較高劑量組大鼠的IVS值、LVPW值較前降低(P<0.05)，較低劑量組變化無統(tǒng)計學意義，且較高劑量組低于較低劑量組和模型組。見表1。

表1 四組大鼠基線、建模成功及干預2周后IVS、LVPW值比較 (mm)

2.3 病理結果正常對照組大鼠心肌組織結構完整清晰，心肌纖維形態(tài)正常。而模型組大鼠心肌細胞顯著增大，炎性細胞浸潤，心肌纖維化加重。與模型組相比，干預組大鼠上述心肌病理均有所緩解，結構更完整，以較高劑量組明顯。馬松染色可見，與正常對照組相比，其余三組均出現(xiàn)不同程度的心肌纖維化，纖維組織明顯增生；與模型組相比，干預組大鼠心肌纖維化程度均有所減輕；與較低劑量組相比，較高劑量組心肌纖維化程度進一步減輕。鹽酸小檗堿能在一定程度上減輕異丙腎上腺素誘導的膠原纖維增生。

2.4 大鼠心肌組織 Rho/ROCK信號通路蛋白量比較與正常對照組相比，其余三組大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達量升高，P-PTEN蛋白表達量均有所降低(均P<0.05)。此外，與模型組相比，較低劑量組和較高劑量組大鼠RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達量均有所降低，P-PTEN蛋白表達量均有所升高(均P<0.05)；與較低劑量組相比，較高劑量組RhoA、ROCK、TGF-β1蛋白表達量進一步降低，P-PTEN蛋白表達量進一步升高(均P<0.05)。見表2、圖1。

表2 四組大鼠心肌組織Rho/ROCK通路蛋白量

圖1 四組大鼠心肌組織P-PTEN、TGF-β1、ROCK 、RhoA免疫染色結果 (×200)

3 討論

心力衰竭是一種全球性流行病，全世界估計有2600萬人受到影響，也正在成為亞洲最常見的心臟病之一，5年和10年死亡率分別為50%和90%[7]。心肌肥厚是心力衰竭的最主要形式，病理性心肌肥厚可由高血壓、心肌梗死和瓣膜性心臟病引起[8]。心臟的壓力或容量超負荷(例如，由于高血壓或瓣膜紊亂)可誘導心肌肥大，這最初是一種代償性反應，但持續(xù)的超負荷最終會導致充血性心力衰竭、心律失常和猝死[2]。此外，氧化應激、能量代謝紊亂、血流動力學因素、神經(jīng)體液因子、心血管自分泌/旁分泌因子、胰島素抵抗、microRNA和遺傳學等多層次復雜因素參與了心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展。盡管心肌肥厚的確切分子機制仍不完全清楚，但在心臟疾病的早期階段提供正確的治療可能會誘導左心室恢復其正常的功能和結構[9]。因此，尋找新的化合物延緩或逆轉心肌肥厚是很重要、迫切的。

小檗堿是一種異喹啉生物堿，廣泛存在于小檗科、罌粟科、貓爪草、茜草科、半月板花屬植物中，是中藥的組成部分，具有多種藥理作用。它最初被用于治療腸道炎癥，因為它具有顯著的抗微生物活性和抗炎、抗增殖、抗纖維化等特性[10]。小檗堿已成為治療心血管、內分泌和腸道疾病的有效藥物[11]。有研究表明，植物化學物質可以通過調節(jié)信號傳導通路從而抑制病理性心肌肥厚，主要包括PKC通路、CaN通路和MAPK通路等[12]。在近期的報道中稱鹽酸小檗堿可有效抑制心肌肥厚[6]，然而其作用機制尚不明確。

大鼠的心臟通常被用作人類健康和疾病狀態(tài)下的心臟實驗模型[13]，β-腎上腺素受體的持續(xù)激活可誘導病理性心肌肥厚、心肌纖維化和心肌缺血。ISO是一種強大的合成非選擇性β-腎上腺素受體激動劑，已被廣泛用于心肌肥厚模型[14]。本研究中，給予大鼠腹腔注射3 mg/kg的異丙腎上腺素7天后，可觀察到心肌IVS、LVPW厚度均明顯升高，且在病理下可以觀察到大鼠心肌細胞形態(tài)不規(guī)則、心肌細胞顯著增大，炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生明顯，顯示在研究中ISO誘導了典型的心肌肥厚模型。

心力衰竭是最常見的心血管疾病且是大部分心血管疾病的終末階段，在細胞水平上，心肌肥厚的特征是細胞增大和胎兒基因程序的重新激活，以及細胞骨架的重組[15]。心肌肥厚作為心力衰竭的生物學基礎受多種信號通道調控，如Akt、 P13K、MAPK、AMPK、GPCRs等信號通路，大多數(shù)學者認為通過調控相關信號通路可以調控整個心肌肥厚過程達到改善或逆轉心肌肥厚的目的，繼而治療心力衰竭[16]。Rho/Rock信號通路是體內重要的信號轉導通路，RhoA是Rho蛋白家族的主要成員，而Rho激酶(ROCK)為Rho下游靶效應分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[17]，能接受Rho傳遞的信號，激活ROCK能使多個氨基酸位點發(fā)生磷酸化，并介導下游一系列的磷酸化與脫磷酸化反應，產(chǎn)生多種細胞學效應[18]。有研究發(fā)現(xiàn)異常高表達的Rho會引起心肌肥厚、心室重塑、心肌功能下降及心力衰竭[19]。腫瘤抑制因子P-PTEN在心肌細胞、內皮細胞和成纖維細胞廣泛表達，與細胞的生長、分化、凋亡調控有關，PTEN能調節(jié)心肌細胞肥大及存活，越來越多的研究證實，心肌細胞中PTEN的特異性失活導致心肌肥厚，有報道稱敲除PTEN基因可致心肌肥厚，并減低心肌的收縮性[20，21]。在本研究中我們可以觀察到由異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚大鼠，其IVS和LVPW均明顯增厚，且心肌組織中RhoA和ROCK的表達量明顯高于正常對照組大鼠，說明Rho/ROCK信號轉導通路參與心肌肥厚肥厚過程，而使用較高劑量鹽酸小檗堿干預后，可以發(fā)現(xiàn)心肌IVS、LVPW厚度減輕，在較低劑量組中也呈現(xiàn)降低趨勢，這時心肌組織中RhoA和ROCK的表達量均有所降低，說明鹽酸小檗堿可能通過抑制Rho/ROCK信號轉導通路從而改善心肌肥厚，且在抑制該通路上可能存在劑量依賴性。

心臟纖維化是許多心血管疾病常見病理特征，并且是參與心血管疾病惡化過程的重要因素[22]。Rho/Rock信號轉導通路能夠調控細胞增殖，參與組織損傷修復和再生，在心肌纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[17]。轉化生長因子TGF-β1是目前能誘導成纖維細胞增殖和膠原合成最為明顯的細胞因子之一[23],TGF-β1已被證實是Rho/ROCK信號通路的上游激活因素，而ROCK又可以誘導心肌細胞大量釋放TGF-β1促進纖維化[19]。在病理觀察下可以發(fā)現(xiàn)到由異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚大鼠均出現(xiàn)不同程度的心肌纖維化，其TGF-β1表達均有所升高，而在使用鹽酸小檗堿干預后的大鼠心肌組織中，心肌纖維化程度減輕，TGF-β1表達均有所降低，提示鹽酸小檗堿可以通過抑制Rho/ROCK信號通路、降低TGF-β1表達從而減輕心肌纖維化，減少細胞外基質的分泌。這也與陳志冬等[24]的發(fā)現(xiàn)相一致。本研究結果也說明了TGF-β1參與心肌肥厚和左心室纖維化，這也和既往的研究相符[25]。

綜上所述，本研究提示鹽酸小檗堿能改善心肌肥厚，抑制心肌纖維化，其機制可能與是抑制Rho/ROCK通路、調整TGF-β1、P-PTEN表達量有關。