祝欣萍，賈 迪，林少輝，劉 晨，李婧銥，趙煒明，2，*

(1．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

肝癌是源于肝細(xì)胞和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，全世界每年約有90.5萬例肝癌新發(fā)病例和83萬例肝癌引起的死亡病例[1-2]。手術(shù)切除、肝移植、局部消融、化學(xué)治療是肝癌患者的主要治療方式[3]。索拉菲尼、阿霉素、順鉑等藥物作為臨床治療肝癌常見的化療藥物[4]，長期使用可產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用并可引起腫瘤耐藥[5]。因此，探尋新型低毒、高效的抗癌藥物具有重要意義。

多金屬氧酸鹽(polyoxometalates，POMs)是由前過渡金屬離子通過氧連接而形成的一類多金屬氧簇化合物[6]。POMs藥物具有低毒性、高活性的特點，能顯著抑制腫瘤生長和血管生成[7]，是抗癌治療的潛在候選藥物。多項研究表明[8-11]，POMs藥物對包括胰腺癌、白血病、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌在內(nèi)的多種腫瘤均有治療作用。2020年，Razavi等[7]合成的高負(fù)電荷Preysler POM負(fù)載納米脂質(zhì)體可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長并促進細(xì)胞凋亡。同年，Joshi等[12]合成了一種新型的多鉬酸鹽基有機-無機雜化固體并通過誘導(dǎo)MCF-7、A549和HepG2細(xì)胞的凋亡和壞死途徑最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。2021年，孫宏斌等[13]發(fā)現(xiàn)多金屬氧酸鹽SbW9能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和PC9的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

{BiW8O30}是通過新型有機配體及非貴金屬雜原子修飾的多金屬氧酸鹽藥物，分子式為Na6H4[Bi2W20Co2O70(H2O)6]·34H2O。通過綜合運用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，本研究團隊發(fā)現(xiàn)了{(lán)BiW8O30}具有激活肉瘤細(xì)胞焦亡、上調(diào)活性氧水平、抑制DNA修復(fù)等多重作用[14]。但尚未有研究者將{BiW8O30}應(yīng)用于肝癌中，故本研究以肝癌SK-HEP-1細(xì)胞為研究對象，探討{BiW8O30}對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移、侵襲及凋亡的作用，為肝癌治療藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人肝癌細(xì)胞系SK-HEP-1購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于BI公司；胰酶細(xì)胞消化液、青-鏈霉素混合液購于碧云天公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于BioFroxx公司；CCK-8試劑盒購于SEVEN公司，Transwell小室與孔板均購于BioFil公司；Matrigel基質(zhì)膠(356234)購于Corning公司；DAPI和Annexin VAlexa Fluor488/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于四正柏生物；多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}由哈爾濱理工大學(xué)宮麗閣課題組提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SK-HEP-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每2~3 d換液1次；待細(xì)胞生長至匯合度達(dá)70%~80%時按1∶3的比例傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 {BiW8O30}溶液配制 精確稱取{BiW8O30}藥物0.012 4 g，溶于5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基(超聲破碎儀使藥物完全溶解)，0.22μm的濾膜過濾即為400μmol/L的無菌母液。使用時用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至不同處理濃度。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗 常規(guī)消化SK-HEP-1細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔板并鋪勻，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細(xì)胞貼壁且生長匯合度為70%~80%時，設(shè)置4個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24和48 h。終止培養(yǎng)后，加入10μL的CCK-8指示劑，孵育2 h后于450 nm處測定吸光度值D(450)，并計算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。IC50通過GraphPad Prism進行計算。

1.2.4 細(xì)胞集落形成實驗 SK-HEP-1細(xì)胞常規(guī)消化后按500個/mL的濃度接種于6孔板并孵育過夜。待細(xì)胞貼壁，設(shè)置3個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)2周。待6孔板中有明顯的細(xì)胞集落形成，進行染色、拍照。通過ImageJ計數(shù)集落形成數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實驗 SK-HEP-1細(xì)胞以5×105個/mL的濃度均勻接種于6孔板并孵育過夜。待細(xì)胞貼壁且生長匯合度達(dá)90%以上，用10μL槍頭末端在6孔板中央劃痕，PBS清洗2次。設(shè)置3個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200 μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于劃痕后0、24、48 h在同一位置進行拍照。通過ImageJ測量劃痕愈合面積S。

1.2.6 Transwell實驗 Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1∶8的比例稀釋混勻，取45μL均勻鋪到Transwell小室中孵育過夜。待膠凝固，常規(guī)消化SKHEP-1并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，設(shè)置3個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基。200μL細(xì)胞懸液接種于上室，600μL含10%血清的培養(yǎng)基加入下室，分別培養(yǎng)24和48 h。培養(yǎng)終止后，棄掉培養(yǎng)基，棉簽擦掉上室未穿膜的細(xì)胞，甲醇固定60 min，0.1%的結(jié)晶紫染色8 min，PBS淋洗2次，鏡下隨機選取5個視野進行拍照計數(shù)，觀察細(xì)胞侵襲情況。通過ImageJ計數(shù)侵襲細(xì) 胞數(shù)。

1.2.7 DAPI染色 常規(guī)消化SK-HEP-1并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，均勻鋪到6孔板中并孵育過夜。待細(xì)胞貼壁，設(shè)置3個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。然后PBS清洗2次，4%多聚甲醛-20℃固定15 min，PBS沖洗2次，室溫避光染色10 min，PBS沖洗后，于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI熒光染色 SK-HEP-1細(xì)胞以1×105個/mL的細(xì)胞濃度均勻接種于6孔板并孵育過夜。待細(xì)胞貼壁，設(shè)置3個不同濃度的實驗組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為50、100、200μmol/L的{BiW8O30}溶液，對照組采用不含受試藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。完成凋亡刺激后，預(yù)冷PBS洗滌兩次，1 000 r/min離心5 min，200μL的Binding Buffer重懸。依次加入DAPI、Annexin V和PI，室溫避光反應(yīng)30 min，滴1滴反應(yīng)液于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察熒光信號。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究所有實驗均重復(fù)3次及以上，數(shù)據(jù)均采用±s表示。統(tǒng)計分析軟件包括ImageJ、GraphPad Prism，組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)進行統(tǒng)計分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的體外增殖能力

細(xì)胞增殖實驗結(jié)果見圖1，{BiW8O30}作用SKHEP-1細(xì)胞24和48 h的IC50分別為(102.07±1.38)、(74.68±0.91)μmol/L。與 對 照組相比，50、100、200、400μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后，SK-HEP-1細(xì)胞存活率分別降低了29.98%、51.29%、65.81%、83.59%；48 h后SK-HEP-1細(xì)胞存活率分別降低了31.57%、66.23%、81.88%、83.97%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。以上結(jié)果表明{BiW8O30}顯著抑制人肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的體外增殖能力。

圖1 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細(xì)胞的體外增殖能力

2.2 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的集落形成能力

細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果見圖2，與對照組相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理后，SK-HEP-1細(xì)胞的集落形成數(shù)顯著減少，分別降低了28.57%、63.27%、90.82%，表明{BiW8O30}對SK-HEP-1細(xì)胞的集落形成能力具有顯著的抑制作用。

2.3 {BiW8O30}抑制人肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力

劃痕實驗結(jié)果見圖3，與對照組相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后，SK-HEP-1細(xì)胞的劃痕愈合率降低了8.47%、70.59%、80.83%；48 h后，SK-HEP-1細(xì)胞的劃痕愈合率降低了19.56%、65.98%、75.49%。Transwell實驗結(jié)果見圖4，與對照組相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理后，24 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的SK-HEP-1細(xì)胞數(shù)量降低了27.74%、45.51%、68.77%；48 h內(nèi)穿過基質(zhì)膠的SKHEP-1細(xì)胞數(shù)量降低了47.03%、72.20%、84.07%。以上結(jié)果提示{BiW8O30}可顯著抑制SK-HEP-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

圖2 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細(xì)胞的體外集落形成能力

圖3 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細(xì)胞的體外遷移能力

圖4 {BiW8O30}抑制SK-HEP-1細(xì)胞的體外侵襲能力

2.4 {BiW8O30}誘導(dǎo)人肝癌SK-HEP-1細(xì)胞凋亡

DAPI染色結(jié)果(圖5A)顯示，與對照組相比，50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理24 h后，SKHEP-1細(xì)胞的數(shù)量減少、體積減小，細(xì)胞核濃縮、破裂增多。DAPI/Annexin V-Alexa Fluor488/PI三重?zé)晒馊旧珜嶒灲Y(jié)果(圖5B)顯示，對照組中藍(lán)色熒光信號較強可見，幾乎未檢測到綠色和紅色熒光信號，即活細(xì)胞較多，而凋亡細(xì)胞很少；50、100、200μmol/L的{BiW8O30}處理SK-HEP-1細(xì)胞24 h后，檢測到較強的綠色和紅色熒光，即活細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞增多。以上結(jié)果表明{BiW8O30}誘導(dǎo)肝癌SK-HEP-1細(xì)胞凋亡。

圖5 {BiW8O30}誘導(dǎo)SK-HEP-1細(xì)胞的凋亡

3 討論

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一[15]，由于具有發(fā)病隱匿、早期無典型臨床癥狀的特點，肝癌患者往往被確診時即為肝癌晚期。作為肝癌患者的主要治療手段，常見的化療藥物如索拉菲尼、阿霉素、順鉑等，能夠在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量[16]。然而，長期使用化療藥物可對人體的器官造成嚴(yán)重毒副作用，同時也可引發(fā)腫瘤產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響療效[1]。因此，迫切需要開發(fā)具有藥物療效和安全性的新藥物以改善肝癌的治療。本課題組前期研究表明，新型多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}在肉瘤治療中具有顯著抗腫瘤作用[15]。為探究該藥物是否適用于其他腫瘤，本研究首次將多金屬氧酸鹽藥{BiW8O30}應(yīng)用于肝癌細(xì)胞。結(jié)果顯示{BiW8O30}可通過抑制肝癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移、侵襲和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究采用CCK-8法細(xì)胞增殖實驗，檢測{BiW8O30}對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖能力被顯著抑制，且呈劑量依賴性降低。IC50為藥物抑制細(xì)胞生長50%所需濃度。已有研究發(fā)現(xiàn)，臨床常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)作用肝癌SK-HEP-1細(xì)胞24 h的IC50為115μmol/L[17]，而本研究中{BiW8O30}作用肝癌SK-HEP-1細(xì)胞24 h的IC50為(102.07±1.38)μmol/L。這一結(jié)果表明{BiW8O30}在肝癌治療中具有較大潛力。在前期研究中，{BiW8O30}作用肉瘤細(xì)胞MG-63的IC50為127.3μmol/L[15]，這提示{BiW8O30}對肝癌細(xì)胞具有更強的細(xì)胞毒作用，也表明{BiW8O30}可能具有治療多種腫瘤的潛力。細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果顯示，{BiW8O30}顯著抑制了肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性和增殖能力。已有的關(guān)于多金屬氧酸鹽藥物抗肝癌作用的研究，主要采用低轉(zhuǎn)移潛能的HEP-G2肝癌細(xì)胞株。而本研究對象SK-HEP-1具有較高的侵襲與轉(zhuǎn)移潛能，惡性程度較高，利于研究藥物對肝癌轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示，隨著{BiW8O30}作用濃度和作用時間的增加，肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制，提示{BiW8O30}可能抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

形態(tài)學(xué)觀察顯示，{BiW8O30}給藥后，肝癌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞皺縮、體積減小、細(xì)胞核固縮碎裂以及形成凋亡小體等改變，提示{BiW8O30}可誘發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn){BiW8O30}抗肉瘤作用的方式之一是誘導(dǎo)肉瘤焦亡。同一種藥物誘導(dǎo)出兩種不同的死亡方式，引起了我們極大的興趣。近年來，隨著對細(xì)胞死亡方式的深入研究[18]，研究者發(fā)現(xiàn)不同類型的程序性死亡可以歸納為一個單一的、協(xié)調(diào)的細(xì)胞死亡系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，細(xì)胞內(nèi)各信號通路高度相互關(guān)聯(lián)，相互補償。2019年Malireddi等[19]發(fā)現(xiàn)了一條新型細(xì)胞死亡途徑，稱為PANopossis，此通路由PANoptosome復(fù)合體調(diào)控，焦亡、凋亡和程序性壞死同時參與。

凋亡、焦亡、程序性壞死是細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)中的3個關(guān)鍵途徑。其中，凋亡由半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活、調(diào)亡小體的形成介導(dǎo)，焦亡由炎性小體的調(diào)節(jié)、Gasdermin家族成員的激活介導(dǎo)，程序性壞死由RIPK1、RIPK3和MLKL的激活，胞質(zhì)壞死小體的形成介導(dǎo)[20]。3條途徑既能獨立激活，又能相互關(guān)聯(lián)[21]。如凋亡和焦亡通路的介導(dǎo)均依賴Caspase家族成員的激活，焦亡和程序性壞死的發(fā)生均有炎性因子的釋放，凋亡、焦亡、程序性壞死均有脂質(zhì)過氧化的參與等。以往的大部分研究都集中在個別的細(xì)胞死亡方式上，而不同的PCD途徑是否是獨立發(fā)生的尚不清楚，仍有待進一步研究。結(jié)合本課題組前期研究和上述結(jié)果，{BiW8O30}是否通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多種死亡方式，從而起到抗腫瘤作用，其機制又是否與PANoptosis新型死亡途徑相關(guān)，有待我們進一步探究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)新型多金屬氧酸鹽藥物{BiW8O30}對肝癌SK-HEP-1細(xì)胞的體外抗腫瘤作用。{BiW8O30}可顯著抑制肝癌細(xì)胞SK-HEP-1的增殖、遷移和侵襲能力，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究為今后該藥物在肝癌治療中的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，具有重要現(xiàn)實意義和臨床價值。