趙 巖，孫震曉*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

二甲雙胍作為臨床上廣泛應(yīng)用于2型糖尿病患者的藥物，研究表明，接受二甲雙胍治療的2型糖尿病患者的癌癥發(fā)生率和死亡率明顯降低[1-3]。近年來(lái)，二甲雙胍的抗腫瘤功效受到持續(xù)關(guān)注，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明二甲雙胍可以抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡[4-5]。目前的研究表明，二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制表現(xiàn)在特異性激活單磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)，進(jìn)而影響其下游的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用[6-7]；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯[8-9]；增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療治療的敏感性[10]等。

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥之一，其死亡率僅次于肺癌[11]，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)作為其中的一個(gè)分型，是指雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2表達(dá)均為陰性的一類(lèi)乳腺癌，占所有乳腺癌患者的15%~20%，其生存率要遠(yuǎn)低于非TNBC患者[12]，主要原因在于該分型的腫瘤細(xì)胞具有分化程度低、增殖能力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。目前，化療仍是臨床上采用的主要治療手段，但化療耐藥性及TNBC本身轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的特點(diǎn)是其治療中的主要障礙[13]。流行病學(xué)研究表明，服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的乳腺癌發(fā)病率和死亡率[14]。因此，本研究選擇人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，探討二甲雙胍體外是否對(duì)其增殖和遷移有抑制作用，為進(jìn)一步開(kāi)展二甲雙胍抗三陰性乳腺癌的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，由北京中醫(yī)藥大學(xué)生物制藥系凍存；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于Gibco公司；青霉素、鏈霉素溶液購(gòu)于Amresco公司；MTT購(gòu)于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；二甲雙胍，純度≥98%，購(gòu)于北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)孔板，8.0μm孔徑Transwell小室均購(gòu)于Corning公司；MCO-18AIC(UV)細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于Sanyo公司；Nikon ECLIPSE TE2000-S倒置相差顯微鏡，Nikon ECLIPSE TE200正置顯微鏡購(gòu)于Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞按每孔1.5×103個(gè)接種至96孔板中，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁并且生長(zhǎng)良好時(shí)，加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基和含不同濃度二甲雙胍(1、2、4 mmol/L)的含藥培養(yǎng)基，作用時(shí)間分別為48和72 h。到達(dá)作用時(shí)間后吸去培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT 100μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，倒去MTT，加入150μL的DMSO震蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)溶液的吸光度D(570)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力[15]。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1。加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基和含不同濃度二甲雙胍(1、2、4 mmol/L)的含藥培養(yǎng)基，作用時(shí)間為72 h。倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組和加藥組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)學(xué)變化，拍照記錄。

4 mmol/L二甲雙胍作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，離心涂片后自然晾干，無(wú)水乙醇固定3 min。Giemsa貯存液與PBS按1∶5混合后離心，取上清滴加在細(xì)胞上，染色15~20 min，洗去染液，正置顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，以每孔4.8×105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔板中，接種后輕晃細(xì)胞培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻且單層分布，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)到95%以上時(shí)準(zhǔn)備劃痕。用10μL白色槍頭垂直沿著無(wú)菌直尺劃痕。之后用PBS輕輕洗滌處理孔3次，洗去劃下來(lái)的細(xì)胞，并拍照記錄(0 h)。加入含不同濃度二甲雙胍的的培養(yǎng)基(2、4 mmol/L)，對(duì)照組使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后拍照。使用ImageJ軟件的劃痕面積分析模塊得到劃痕面積S，并按下列公式[16]計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)夜，消化離心收集細(xì)胞，使用無(wú)FBS，含不同濃度二甲雙胍(2、4 mmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，按每孔100μL即2×104個(gè)細(xì)胞接種至上室，在下室加入600μL含10%FBS的RPMI 1640，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出Transwell小室，棄去上室培養(yǎng)液，并使用PBS清洗兩次，然后用濕棉簽擦去膜上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，并用蒸餾水清洗數(shù)次以除去殘留固定液。將小室置于0.1%結(jié)晶紫中染色30 min，用蒸餾水將浮色漂洗干凈后于正置顯微鏡下(40×)拍照(ImageView拍照軟件)，使用ImageJ統(tǒng)計(jì)膜下層細(xì)胞數(shù)。按參考文獻(xiàn)[17]的方法分析不同處理組對(duì)細(xì)胞穿膜能力的影響。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。細(xì)胞活力，劃痕愈合率及穿膜細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對(duì)人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，與對(duì)照組比較，可見(jiàn)二甲雙胍在濃度為1、2 mmol/L時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力無(wú)明顯抑制作用，在濃度為4 mmol/L作用72 h時(shí)可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力(P＜0.01)，抑制率為(29.83±2.25)%。

圖1 二甲雙胍作用48和72 h后對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞活力的影響

2.1.2 二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響倒置顯微鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍濃度為1 mmol/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化；當(dāng)二甲雙胍濃度為2 mmol/L時(shí)，視野中變圓的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞密度有所降低；而當(dāng)二甲雙胍濃度為4 mmol/L時(shí)，細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞與細(xì)胞間聯(lián)系減少。結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明二甲雙胍明顯抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞經(jīng)Giemsa染色后光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)正常，而4 mmol/L的二甲雙胍組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象。

圖2 倒置顯微鏡下觀察二甲雙胍作用72 h后MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖3 Giemsa染色觀察二甲雙胍作用48 h后MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.2 二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響

2.2.1 二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞劃痕愈合的抑制作用體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，與對(duì)照組比較，用2、4 mmol/L的二甲雙胍處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，藥物處理組細(xì)胞匯合程度明顯降低。2、4 mmol/L二甲雙胍處理組劃痕愈合率分別為(55.76±2.41)%、(52.67±4.48)%，與對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)。

圖4 二甲雙胍作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后劃痕愈合情況

2.2.2 二甲雙胍對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞穿膜能力的抑制Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，不同濃度的二甲雙胍處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，視野下穿膜細(xì)胞數(shù)目明顯減少。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示二甲雙胍處理MDAMB-231細(xì)胞后，與對(duì)照組相比發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(99.3±18.9)個(gè)，2、4 mmol/L二甲雙胍處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(61.6±1.6)、(51.3±2.6)個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖5 二甲雙胍作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后的穿膜情況

3 討論

二甲雙胍作為臨床廣泛使用的藥物，其治療2型糖尿病的效果和安全性已得到充分肯定。目前，除了體外實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍的抗腫瘤功效外，也有研究表明二甲雙胍也可以在體內(nèi)抑制乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)[18-19]。本研究選用了遷移能力較強(qiáng)的人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，首先，結(jié)合細(xì)胞活力測(cè)定和形態(tài)觀察，確定二甲雙胍體外抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖情況，其次，選擇合適的藥物濃度，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察二甲雙胍對(duì)該細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果表明，2、4 mmol/L濃度的二甲雙胍可以顯著抑制該細(xì)胞的遷移能力，但是，二甲雙胍是通過(guò)何種分子機(jī)制調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究闡明。

腫瘤作為一種多因素共同作用引起的復(fù)雜疾病，兩藥或多藥聯(lián)合使用已在臨床證明比單藥使用抗腫瘤效果更優(yōu)[20-21]，二甲雙胍與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用逐漸為大家所關(guān)注。有實(shí)驗(yàn)表明，二甲雙胍與醋酸諾美孕酮聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，使子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2和HEC-1A的增殖抑制率分別提高了12.8%和17.1%[22]。二甲雙胍和順鉑聯(lián)用與分別單用相比可明顯降低TNBC細(xì)胞的存活率，同時(shí)，細(xì)胞遷移和侵襲的現(xiàn)象也明顯減弱[23]。任翠等[24]研究發(fā)現(xiàn)，新型厚樸酚-二甲雙胍綴合物低、高劑量組均可抑制小鼠人肝癌細(xì)胞HepG2移植瘤生長(zhǎng)，且并未產(chǎn)生不良反應(yīng)，該研究提供了一種將不同功效的兩種藥物以人工合成的方法，拼接成具有多個(gè)核心作用的綴合物分子，以期能達(dá)到增強(qiáng)藥效或增加藥物作用靶點(diǎn)的效果。未來(lái)研究可以在揭示二甲雙胍抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索二甲雙胍與臨床抗腫瘤藥物聯(lián)用的效果。