陳東亞，陸羅定，陳 耿，張 穎，俞 萍，呂中明，卞 倩*

(江蘇省疾病預防控制中心毒理與風險評估研究所，江蘇 南京 210009)

目前的流行病學研究表明長期暴露于環(huán)境細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)中，可能引發(fā)哮喘、肺功能下降、心血管疾病、神經毒性等[1-4]。PM2.5主要成分為礦物粉塵、多環(huán)芳烴、硫酸鹽和銨等[5]，因為其能沉積在呼吸道及肺泡中，且難以清除，其所致?lián)p傷主要表現(xiàn)為肺部炎性病變，炎性細胞浸潤和炎性因子如白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-6(interleukin-6，IL-6)等的增加[6-8]。

丹參酮ⅡA磺酸鈉(sulfotanshinone sodium，STS)是從中草藥丹參中提取并磺化的物質，具有改善血液循環(huán)、促進血管內皮細胞修復、抗血栓等作用，目前臨床已被廣泛用于治療心血管疾病，其更多藥理作用還在被繼續(xù)探索。Xu等[9]報道，STS可通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)通路介導的細胞凋亡和炎癥反應來減輕脂多糖引起的小鼠急性肺損傷。高輝等[10]報道，STS聯(lián)合布地奈德和異丙托溴銨霧化吸入可顯著改善慢性阻塞性肺病急性加重期患者的肺功能和免疫功能。而目前關于STS對PM2.5誘導的肺部炎癥的相關研究較少。因此本研究在建立PM2.5氣管滴注大鼠肺部炎癥模型基礎上，探索STS對大鼠肺部炎癥反應的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑包括：STS(上海第一生化藥業(yè)有限公司)；空氣細顆粒物標準物質(美國國家標準和技術研究所)；地塞米松片(廣東華南藥業(yè)集團有限公司)；大鼠CD3-4-8檢測試劑盒(美國BD公司)；IL-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6 ELISA檢測試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司)；細胞漿和細胞核蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗NF-κB P65多克隆抗體及磷酸化p-P65多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

主要儀器包括：酶標儀(Paradigm型，美國MD公司)；小動物肺功能-全身體積描記檢測系統(tǒng)(WBP型，美國BUXCO公司)；低溫高速離心機(MIKRO 220R型，德國Hettich公司)；流式細胞儀(C6，美國BD公司)；Mini-PROTEAN型電泳儀和Trans-Blot型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；成像儀(C280型，美國Azure Biosystems公司)。

1.2 造模及給藥

24只清潔級雄性SD大鼠，初始體質量180~200 g，動物生產許可證號為SXK(蘇)2016-0002，由南京醫(yī)科大學提供，在動物飼養(yǎng)室適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組6只，分別為對照組、PM2.5染毒組(模型組)、丹參酮ⅡA磺酸鈉組(STS組)、地塞米松組(陽性對照)。染毒濃度設定依據參見本課題組前期發(fā)表的論文[11]。本研究采用氣管滴注PM2.5懸液染毒，除對照組氣管滴注生理鹽水外，其余3組染毒劑量均為5.4 mg/kg，每3 d滴注1次，共10次，于染毒第1天起STS組和地塞米松組分別以濃度15 mg/kg和0.5 mg/kg腹腔注射，每天1次，持續(xù)28 d。末次染毒后2 d，經腹主動脈采血2 mL，處死后灌洗左肺，收集肺泡灌洗液5 mL，右肺上葉置于液氮凍存。

1.3 大鼠呼吸功能測定

末次染毒后24 h，采用整體體積描記法(whole body plethysmography，WBP)，將大鼠置于測量腔內，在安靜且溫度和濕度適宜環(huán)境中，適應10 min，待呼吸波形平穩(wěn)后，測定各組大鼠的呼吸頻率(respiratory frequency，f)和被迫呼吸間隙(enhanced pause，Penh)。

1.4 血液淋巴細胞亞群分析和肺泡灌洗液炎癥因子檢測

分離各組大鼠血液淋巴細胞，將濃度調整為1×106個/mL，取100μL淋巴細胞懸液分別與CD3和CD4、CD3和CD8的抗體組合孵育。樣品在室溫下黑暗處孵育20 min，PBS洗滌兩次后，使用流式細胞儀測定每個樣本1×104個淋巴細胞的熒光強度，分析CD3+、CD4+和CD8+比例。

肺泡灌洗液炎癥因子的檢測，按照IL-1β、TNFα和IL-6 ELISA試劑盒含量檢測說明書操作。

1.5 Western blot檢測NF-κB蛋白表達

按照說明書分別提取肺組織細胞核、細胞漿蛋白。BCA法測定蛋白含量，煮沸變性后，取40μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜，將膜室溫封閉1 h，一抗NF-κB P65、磷酸化p-P65、GAPDH和Lamin B1均為1∶1 000稀釋，4℃過夜，二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h，洗滌后ECL化學發(fā)光顯影，Azure成像系統(tǒng)檢測條帶，利用Image J1.52V軟件對條帶灰度值進行測定，與對應內參比較后，計算相對值。

1.6 統(tǒng)計學檢測

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析，各組數(shù)據用±s表示，當多組間方差齊時，使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；方差不齊時，采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 STS對染毒后大鼠肺功能的影響

如表1所示，與對照組相比，模型組呼吸f值和Penh值均明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組呼吸f值的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而被迫呼吸間隙Penh值均降低(P＜0.05或P＜0.01)；另外，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間f值和Penh的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠肺功能變化(n=6，±s)

表1 各組大鼠肺功能變化(n=6，±s)

與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別對照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組呼吸頻率/(次/min)251.31±22.91 286.29±14.23**269.80±19.19 266.53±13.91被迫呼吸間隙0.43±0.08 0.62±0.13**0.46±0.04##0.50±0.09#

2.2 STS對染毒后大鼠外周血淋巴細胞的影響

如表2所示，各組大鼠外周血淋巴細胞CD3+、CD8+細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義，與對照組比較，模型組CD4+細胞百分率降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值降低(P＜0.05)；相較于模型組，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組CD4+細胞百分率均升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值亦升高(P＜0.01或P＜0.05)，但丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間CD4+細胞百分率和CD4+/CD8+比值的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群比較(n=6，±s)

表2 各組大鼠外周血中T淋巴細胞亞群比較(n=6，±s)

與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.表格中CD4+數(shù)據方差不齊，采用非參數(shù)檢驗，其他數(shù)據統(tǒng)計采用單因素方差分析.

組別對照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組CD3+/%64.71±3.92 61.81±3.49 65.95±4.02 62.25±1.85 CD4+/%31.05±2.65 23.20±1.63**33.40±3.98##27.82±2.38##CD8+/%25.25±3.44 23.02±2.62 24.02±2.84 23.82±1.90 CD4+/CD8+1.25±0.18 1.02±0.14*1.36±0.26##1.17±0.09#

2.3 STS對大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組IL-1β、TNF-α和IL-6濃度均降低(P＜0.01或P＜0.05)，但丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(n=6，±s)

表3 各組大鼠炎癥因子IL-1β、TNF-α及IL-6的表達(n=6，±s)

與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別對照組模型組丹參酮ⅡA磺酸鈉組地塞米松組IL-1β/(ng/L)33.79±4.99 41.72±3.04**35.83±2.77#34.37±3.77##TNF-α/(ng/L)278.64±34.25 359.43±36.22**310.95±30.64#305.82±30.35#IL-6/(ng/L)146.39±18.24 182.21±15.64**156.86±16.05#153.44±17.23#

2.4 STS對NF-κB P65和p-P65蛋白表達的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組肺細胞漿中P65含量降低(P＜0.01)，細胞核中p-P65含量升高(P＜0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組細胞漿中P65含量升高(P＜0.05)，細胞核中p-P65含量降低(P＜0.01)；另外，丹參ⅡA磺酸鈉組和地塞米松組間的差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

圖1 各組大鼠肺細胞漿和細胞核中NF-κB P65和p-P65蛋白表達(n=3)

3 討論

大氣PM2.5引起的非傳染性疾病已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題[12-13]，因此PM2.5對機體的損傷機制和干預方法的探索成為當前的研究熱點。本研究采取大鼠氣管滴注染毒法造模，并對STS的干預作用進行評價。

在研究PM2.5對肺部影響時，肺功能指標是一項直觀的數(shù)據，有報道表明人類長期吸入細顆粒物會引起呼吸功能下降，造成肺部損傷[14-15]。本研究采用無創(chuàng)WBP法對大鼠肺功能進行檢測，相比于有創(chuàng)檢測法，該方法操作較簡便，動物始終保持清醒狀態(tài)，減少了手術和麻醉對指標的影響，且不影響后續(xù)其他指標的檢測。當大鼠出現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡腔減小、肺間質炎性細胞浸潤、肺間質纖維化等病理改變時，f和Penh數(shù)值增加，提示肺部通氣不足，氣道阻力增加，且與炎癥程度相關[16-17]。本課題組前期結果表明STS能改善PM2.5染毒后大鼠肺組織炎性病理改變[11]，本研究結果顯示模型組大鼠f和Penh增加，而STS組和地塞米松組能改善PM2.5引起的肺功能下降，降低f和Penh，與前期病理研究改變結果一致。

血液T淋巴細胞亞群在正常機體中呈現(xiàn)相互作用，相互平衡，維持機體正常細胞免疫功能。研究[18]報道，吸入PM2.5導致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)小鼠T淋巴細胞失衡，并使COPD加重。朱敏立等[19]發(fā)現(xiàn)空氣污染導致大鼠T淋巴細胞構成異常。本研究中，與對照組相比，模型組大鼠染毒后CD4+細胞百分率降低，CD4+/CD8+比值降低；而與模型組相比，STS組通過升高CD4+細胞數(shù)，提高CD4+/CD8+比值改善PM2.5導致的T淋巴細胞亞群比例失衡，達到免疫平衡狀態(tài)，這與之前報道的STS具有免疫調節(jié)作用相一致[20-21]。而地塞米松組CD4+/CD8+比值與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義，調節(jié)T淋巴細胞亞群比例的作用不如STS，可能與地塞米松誘導免疫抑制有關。

由肺泡巨噬細胞釋放的IL-1β是PM2.5暴露后釋放的急性反應細胞因子，與細胞表面受體結合后，激活JNK或p38通路，促進TNF-α等細胞因子分泌[22]。TNF-α也是肺部炎癥的早期細胞因子之一，由肺泡巨噬細胞和肺泡上皮細胞釋放，促進循環(huán)中炎癥細胞與內皮細胞的黏附[23]。IL-6主要來源于單核-巨噬細胞系統(tǒng)，具有促進細胞增殖分化、調節(jié)免疫應答等功能，通過自分泌或旁分泌的形式參與氣道和肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展[24-25]。有研究[26]表明，PM2.5通過激活IKK/NF-κB信號途徑激活NF-κB P65，使其磷酸化為p-P65并進入細胞核提高炎癥因子水平。PM2.5通過誘導自噬，增加P65磷酸化促進炎癥因子表達[27]。此外，IL-1β和TNF-α能誘導抑制蛋白IκB的快速磷酸化和降解來誘導NF-κB快速核移位，通過反向調節(jié)進一步從轉錄水平調節(jié)炎癥因子的表達，加重肺部炎癥[28-29]。本實驗模型組大鼠經PM2.5染毒后，肺泡灌洗液中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6濃度與對照組相比明顯升高，細胞核內p-P65蛋白含量增加，這與之前研究報道一致，而STS組和地塞米松組大鼠炎癥因子水平和核內p-P65蛋白含量降低，說明兩者能通過降低炎癥因子表達，抑制NF-κB P65激活，減輕肺部炎癥。

STS是從丹參根部提取的主要成分，具有丹參大部分藥效特性，且副作用小[30]。研究[31]表明STS可以減少腦動脈閉塞大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，通過減少NF-κB P65磷酸化降低神經炎癥。李春陵等[32]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔注射32 mg/(kg·d)STS，14 d后通過上調PPARγ蛋白表達，下調NF-κB蛋白表達，抑制氣道重塑因子TNF-α、IL-6水平，從而防止COPD大鼠氣道重塑。在課題組前期研究基礎上，本研究通過肺功能、免疫功能和炎癥因子檢測，進一步表明STS可能通過抑制NF-κB激活、降低炎癥因子表達、提高機體細胞免疫能力、減輕肺部炎癥從而改善肺功能。地塞米松作為常用的腎上腺皮質激素，具有較好的抗炎效果，但是長期使用對免疫系統(tǒng)的抑制不容忽視。而多個臨床報告[33-34]表明，STS連續(xù)靜脈滴注4周用于治療冠心病等疾病時，未見嚴重藥物不良反應或并發(fā)癥。因此STS在PM2.5所致肺部炎癥多次給藥治療中具有一定的應用前景。

綜上所述，STS可能通過抑制NF-κB激活，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達，減輕PM2.5導致的大鼠肺部炎癥損傷，改善肺功能和免疫功能。本研究為明確STS對PM2.5致肺部炎癥損傷的干預作用提供了參考依據，但STS具體作用靶點，如何抑制NF-κB激活的上游因子，以及是否通過其他途徑調節(jié)機體損傷均有待進一步研究。另外，可嘗試改變染毒方式為全身暴露染毒等作更深入探討。