國瑞賢，謝廣云*，韓 瑩*

(1．中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；2．中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；3．中國食品藥品檢定研究院化學(xué)藥品檢定所抗生素室，北京 102629)

【關(guān)鍵字】加替沙星；肝毒性；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；差異表達(dá)基因；小鼠

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是一種常見的廣譜殺菌藥物，因其與很多抗菌藥物之間的交叉耐藥性比較低，廣泛應(yīng)用于治療人類、農(nóng)場動物和鳥類感染性疾病[1-3]。但是在臨床使用中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Qs會對患者的肝臟造成一定的損傷[4-6]。曲伐沙星因其有致肝炎甚至嚴(yán)重肝衰竭等不良反應(yīng)被撤出市場[7]。據(jù)研究表明[8]，F(xiàn)Qs中涉及肝毒性的共有環(huán)丙沙星、莫西沙星、氧氟沙星、洛美沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、加替沙星、依諾沙星等8個品種。FQs是我國生產(chǎn)和使用最為常見的一類抗生素，故研究FQs的毒理效應(yīng)對于其安全性評價具有重要意義。

加替沙星(gatifloxacin，GAT)是第四代氟喹諾酮類藥物的典型代表藥物，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外市場。由于可能產(chǎn)生低血糖或高血糖等嚴(yán)重乃至致命的不良反應(yīng)，該藥物從美國和加拿大市場上被撤銷。而中國和其他一些發(fā)展中國家仍在使用GAT作為藥物[9]。臨床上報道[10]，它會引起惡心、頭暈、躁動和焦慮。Oladapo Rotimi等[11]研究了10、20、40和80 mg/kg 4個劑量加替沙星對大鼠肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)的表觀遺傳學(xué)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)影響，結(jié)果表明，10 mg/kg的加替沙星即可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和表觀遺傳變化。但是上述研究均未提及肝毒性。GAT在土壤、水和食物中的積累將通過食物鏈增加對人類健康的風(fēng)險，因此需要評估GAT是否會導(dǎo)致肝毒性。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing，RNA-seq)技術(shù)可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化，通過分析不同因素作用下的基因在RNA水平表達(dá)的差異，可以將顯著差異表達(dá)的基因與某些生物學(xué)功能聯(lián)系起來，用于檢測早期損傷標(biāo)志物和分子調(diào)控機制的研究[12]。

為了評估GAT暴露是否會產(chǎn)生肝毒性，本文以SPF級昆明小鼠為研究對象，通過檢測小鼠血清肝功能指標(biāo)變化，采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測對照組和GAT給藥組小鼠肝組織的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化，初步探討加替沙星造成小鼠肝損傷的機制，為深入研究GAT造成人肝損傷的機制提供依據(jù)，并為FQs的環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥物監(jiān)管和風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

加替沙星(GAT，純度97.2%)由中國食品藥品檢定研究院提供。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、肌酐(creatinine，CRE)和甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物與處理

32只SPF級雄性昆明小鼠(26~28 g)購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，動物許可證號SCXK(京)2019-0010。本研究所涉及的動物實驗由中央民族大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn)，動物實驗批準(zhǔn)號ECNUC2021002AO。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為4組，每組各8只。對照組按10 mL/kg灌胃給予雙蒸水。加替沙星低、中、高劑量給藥組分別按25、50、100 mg/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。飼養(yǎng)環(huán)境保持22~24℃的溫度，40%~60%的相對濕度，12 h/12 h晝夜交替。各組小鼠飼養(yǎng)和管理條件相同，每天為小鼠提供干凈的飲用水和食物。給藥7 d后處死小鼠，采血制備血清，取出肝臟并稱取質(zhì)量，按下式計算肝臟系數(shù)。

肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%

1.3 血清肝功能指標(biāo)檢測

采用試劑盒檢測各組小鼠血清中的ALT、AST、AKP、CRE和TG的濃度。

1.4 肝組織轉(zhuǎn)錄組測序

對照組和中劑量GAT組隨機取3只小鼠的肝組織樣本，用0.9%氯化鈉溶液沖洗殘余血跡，即刻置于含5倍量RNA later試劑的EP管中，隨后置于-20℃冰箱備用。用TRIzol試劑(美國Sigma公司)從肝臟組織中提取總RNA，選擇質(zhì)量合格的總RNA作為mRNA測序的建庫起始樣品，其質(zhì)量要求通過Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)檢測，單次建庫要求RNA總量1μg，濃度≥50 ng/μL，D(260)/D(280)介于1.8~2.2之間。用QUBIT RNA Assay Kit對起始的Total RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。隨后，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，對這些cDNA進(jìn)行純化、回收、黏性末端修復(fù)，并進(jìn)行PCR擴增，最后建庫測序。建庫測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 差異表達(dá)基因篩選

將得到的原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)(clean data)用于后續(xù)分析。使用軟件RSEM(http://deweylab.github.io/RSEM/)分別對基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，獲得基因的read counts數(shù)后，進(jìn)行樣本間基因的表達(dá)差異分析。使用edgeR根據(jù)read count進(jìn)行差異表達(dá)水平計算，篩選條件為：FDR＜0.05，|log2FC|≥1。篩選出差異表達(dá)基因(differentially expessed gene，DEG)。

1.6 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

得到DEG后，為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，闡述其在分子水平上的作用，通過使用g：Profiler和Goatools的功能注釋工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋，并采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路富集分析，Bonferroni校正的P＜0.05。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用單因素方差分析法，組間兩兩比較方差齊性時用LSD法，方差不齊時用Dunnettt檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟的質(zhì)量變化

給藥7 d后，各組小鼠的肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)如圖1所示，可見與對照組比較，高劑量GAT組小鼠的肝臟絕對質(zhì)量降低(P＜0.05)，低劑量和中劑量GAT組小鼠的肝臟系數(shù)降低(P＜0.05)。

圖1 加替沙星對小鼠肝臟質(zhì)量的影響

2.2 加替沙星對小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

血清肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果如圖2所示，給藥7 d后，與對照組比較，低、中劑量GAT組小鼠血清ALT水平顯著降低(P＜0.05或0.01)；低劑量GAT組小鼠血清AST水平顯著降低(P＜0.01)。小鼠血清AKP和TG水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且均在正常范圍內(nèi)。3個劑量GAT組小鼠血清CRE濃度較對照組均顯著降低(P＜0.01)。

圖2 加替沙星對小鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

2.3 差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果

使用TPM方法分析對照組和GAT組小鼠肝組織的差異表達(dá)基因，將對照組和中劑量GAT組的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后分析其表達(dá)水平，最終篩選出27個差異表達(dá)基因，其中有20個表達(dá)水平上調(diào)，7個下調(diào)。為直觀的顯示出差異表達(dá)基因，繪制熱圖如圖3所示，顯示出多個基因在兩組中的表達(dá)差異。

圖3 對照組和GAT組小鼠肝組織差異表達(dá)基因熱圖

與對照組比較，20個表達(dá)顯著上調(diào)的基因分別 是：Gm47164、Gm45090、Gm48493、Gm42927、Gm48128、Gm48417、9030169P08Rik、Cyp7a1、Igfbp5、Kcnk5、Insig1、Gck、Myc、Fdps、Mvd、Nsdhl、Idi1、Msmo1、Sqle、Cyp51；7個表達(dá)顯著下調(diào)基因分別是：Nfkbiz、Csf2rb、Csf2rb2、Lepr、Cxcl13、Btg3、Cxcl14。

2.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

GO注釋結(jié)果見圖4，可見27個差異基因在10個生物過程中富集，其中包括免疫過程、多細(xì)胞生物過程、多生物過程、生殖過程、定位和發(fā)育過程、應(yīng)激反應(yīng)、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程；在8個細(xì)胞組分中富集，包括含蛋白復(fù)合物、胞外區(qū)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器等；在2個分子功能中富集，包括催化活性和結(jié)合。

圖4 GAT給藥組中差異表達(dá)基因的GO分析

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對27個差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果見圖5，可見表達(dá)上調(diào)的基因在14條通路中富集，包括脂質(zhì)代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)等；表達(dá)下調(diào)的基因在8條通路中富集，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號分子和相互作用、癌癥總覽等。

圖5 對照組和給藥組差異表達(dá)基因KEGG富集通路直方圖

3 討論

自臨床報道FQs的不良反應(yīng)以來，已有部分藥物被撤市；但是由于部分FQs藥物的不可替代性，仍然應(yīng)用于臨床。GAT作為FQs典型代表藥物，關(guān)于GAT不良反應(yīng)的研究一直備受關(guān)注，其心血管毒性和引起血糖紊亂已被學(xué)界廣泛認(rèn)可，但是GAT引起的肝損傷還未得到證實，其具體機制還需進(jìn)一步探討。

本研究利用小鼠模型初步評價GAT的肝毒性并采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)初步探究其作用機制。結(jié)果顯示，100 mg/kg GAT給藥后可引起小鼠肝臟質(zhì)量降低，25 mg/kg GAT給藥后小鼠血清中ALT、AST和肌酐顯著降低，這提示GAT暴露可造成小鼠肝臟功能的變化。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提取中劑量GAT組肝組織RNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)對照組和中劑量GAT組的差異基因數(shù)目為27個，其中，表達(dá)上調(diào)的基因有20個，下調(diào)的基因有7個。

細(xì)胞色素P450家族成員7A1(cytochrome P450 7A1，CYP7A1)是參與內(nèi)源性膽固醇及其氧化衍生物(氧甾醇)代謝的細(xì)胞色素P450單加氧酶，是膽汁酸生物合成和膽固醇穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，抑制CYP7A1基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)膽汁酸合成、分泌、轉(zhuǎn)運和吸收，可降低肝內(nèi)膽汁酸濃度，避免肝臟過度暴露于膽汁酸而發(fā)生炎性、纖維化等病變。本研究中，與對照組相比，GAT給藥Cyp7a1顯著上調(diào)，提示GAT可能通過膽汁酸合成造成肝內(nèi)膽汁酸濃度失衡，使肝臟暴露于失衡的膽汁酸環(huán)境中而發(fā)生損傷。

CYP51(又名羊毛甾醇14α去甲基化酶)是細(xì)胞色素C家族成員，將羊毛甾醇轉(zhuǎn)化成膽固醇，是分布最廣的細(xì)胞色素P450成員，是膽固醇代謝相關(guān)酶，現(xiàn)已成為降膽固醇藥物研究的熱點。Urlep等[14]研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇合成缺陷可導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化，實驗敲除CYP51基因，實驗動物出現(xiàn)肝臟腫大，伴有卵圓細(xì)胞增生、纖維化和炎癥，但無脂肪變性。且CYP51底物的升高促進(jìn)了綜合應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，與對照組相比，GAT給藥后，Cyp51顯著上調(diào)，提示GAT可能通過膽固醇合成的異常從而導(dǎo)致小鼠肝組織損傷的發(fā)生。

本研究采用高通量測序技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄水平初步探討了GAT致小鼠肝損傷的機制，實驗結(jié)果可為GAT的急性毒理學(xué)分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。鑒于FQs的富集效應(yīng)和可能引起的肝損傷疾病病例，本研究也有助于建立FQs的藥物監(jiān)管和風(fēng)險的理論基礎(chǔ)。此外，本研究可在以下幾個方面作更深入的研究，比如可補充小鼠肝組織的病理變化，直觀地對比GAT給藥造成的組織損傷，以及采用qPCR技術(shù)對通路中的顯著變化基因進(jìn)行進(jìn)一步驗證，以期為日后研究GAT對人的肝損傷作用及其機制提供理論基礎(chǔ)。