辛雨濛，梁桓熙，余悅?cè)A，孫震曉*

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率高于肺癌，成為全球第一大癌癥[1-2]。乳腺癌在中醫(yī)常歸為“乳癌”“石榴翻花發(fā)”“乳巖”“乳石”“乳毒”“奶巖”等?，F(xiàn)代中醫(yī)治療乳腺癌的原則為補虛益腎，疏肝健脾，行氣養(yǎng)血，其與肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)的關(guān)系最為密切[3]。

甘草干姜湯來自張仲景《傷寒雜病論》，也在《金匱要略》中有所記載[4]。甘草甘溫而補中益氣，干姜辛溫而溫復(fù)脾肺之陽，全方躁烈性不強、藥性平和、具有補中復(fù)陽之功，因此可用于脾肺陽虛兼有陰虧的病證[5]。同時甘草或干姜提取物的相關(guān)抗腫瘤實驗研究發(fā)現(xiàn)：甘草查爾酮B處理MCF-7細(xì)胞后可激活p53及其下游效應(yīng)物p21，然后誘導(dǎo)S期停滯[6]；甘草次酸可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移，可能與抑制ERK1/2通路活化，下調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)[7]；6-姜酚引起的Notch信號下調(diào)(Hes1和CyclinD1基因)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞凋亡[8]；異甘草素通過抑制NF-κB信號通路的活化，抑制NF-κB p65入核誘導(dǎo)NCI-H460肺癌細(xì)胞凋亡[9]等。但有關(guān)甘草干姜湯藥效成分的文獻(xiàn)報道較少，僅楊顏芳等[10]研究了甘草干姜湯中8種關(guān)鍵的藥效成分。

近年來，隨著蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)等組學(xué)理論的快速發(fā)展以及系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的應(yīng)用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)出現(xiàn)在人們的視野里。它通過“疾病-基因-靶點-藥物”的相互作用網(wǎng)絡(luò)來系統(tǒng)地分析藥物對疾病的干預(yù)和影響[11]，進(jìn)而解釋中藥多種成分在人體內(nèi)的協(xié)同作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以很好的從多成分、多靶點、多途徑來解釋中藥中復(fù)雜成分的作用機制，對中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展提供了很大的幫助[12]。隨著研究不斷推進(jìn)，越來越多的三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到確認(rèn)，使具有潛在治療功能的藥物靶標(biāo)逐漸增多。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出甘草干姜湯抗乳腺癌可能的作用靶點，并利用文獻(xiàn)報道的甘草干姜湯的8種藥效成分(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚)與潛在的關(guān)鍵靶點進(jìn)行分子對接，預(yù)測甘草干姜湯產(chǎn)生抗乳腺癌作用潛在的主要活性成分及相關(guān)作用靶點，為甘草干姜湯抗乳腺癌作用及機制研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 甘草干姜湯化學(xué)成分收集及藥物靶點預(yù)測

登錄中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫[13](Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmsp-e.com)，設(shè)置搜索條目為Herb name。為篩選甘草、干姜的有效化學(xué)成分，在搜索條目下分別輸入復(fù)方的藥物組成：甘草、干姜。設(shè)置篩選條件為OB(口服生物利用度)≥30%、DL(類藥性指數(shù))≥0.18，另外通過文獻(xiàn)調(diào)研，將不符合類藥篩選但在甘草、干姜中含量高或具有良好抗腫瘤活性的成分加入成分集。完整復(fù)制各中藥符合篩選條件的所有成分于文本文檔中。為篩選LDGD的目標(biāo)靶點，在輸入界面選擇Related Targets，完整復(fù)制各中藥符合篩選條件的所有目標(biāo)靶點于文本文檔中。數(shù)據(jù)庫所獲得的藥物有效化學(xué)成分及靶點信息應(yīng)用Drugbank(https://www.drugbank.ca)使其格式標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點的來源

登錄Genecards人類基因數(shù)據(jù)庫[14](https://www.genecards.org/)。設(shè)置搜索條目為關(guān)鍵詞搜索。搜索條目下以breast cancer為關(guān)鍵詞篩選，設(shè)置物種為人，獲取乳腺癌的疾病靶點。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選擇Relevance score＞30的疾病靶點。對數(shù)據(jù)庫檢索到的疾病靶點進(jìn)行合并去重，作為最終的疾病靶點來源。

1.3 復(fù)方-疾病交集靶點的獲取

在R語言Bioconductor(https://www.bioconductor.org)網(wǎng)站中安裝VennDiagram程輯包，將1.1與1.2中獲得的復(fù)方藥物靶點與疾病靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入到R軟件，應(yīng)用Draw Venn Diagrams程序?qū)Λ@取到的甘草干姜湯藥物靶點與疾病靶點進(jìn)行匹配，獲得交集基因靶點，并繪制Venn圖。

1.4 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將1.3中獲取到的交集基因?qū)氲骄W(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape 3.8.0中，構(gòu)建成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)。對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以節(jié)度中心性作為評價節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及甘草干姜湯抗乳腺癌關(guān)鍵靶點的篩選

登錄String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)。選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入1.3獲取到的交集基因，限定物種為Homo Sapiens，其余設(shè)置保持不變，構(gòu)建PPI功能蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。為篩選核心蛋白，將生成的蛋白相互作用條目Node1、Node2以及Combined-scorce導(dǎo)入到Cytoscape3.8.0，應(yīng)用Network Analyse插件分析網(wǎng)絡(luò)，選擇APP條目下的CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

1.6 GO功能和KEGG信號通路富集分析

使用R語言對甘草干姜湯抗乳腺癌的作用靶點進(jìn)行GO功能富集分析。富集內(nèi)容包括細(xì)胞成分(celluar component，CC)，生 物 學(xué) 過 程(biological process，BP)，分子功能(molecular function，MF)。富集條件為PCutoff=0.05且QCutoff=0.05(為P值校訂值，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GO、KEGG分析)，其余默認(rèn)原始設(shè)置。在R語言中Bioconductor(https://www.bioconductor.org)網(wǎng)站安裝所需要 的Biocmanager，org.Hs.eg.db，Colorspace，Stringi，ggplot2，DOSE，ClusterProfiler，enrichplot，Pathview等程序包。首先將基因Symbol轉(zhuǎn)化為基因ID，選擇物種為人，設(shè)定閾值為P＜0.05，輸出富集結(jié)果并繪制條形圖與氣泡圖。

1.7 分子對接

將文獻(xiàn)報道的甘草干姜湯中8種藥效成分和PPI結(jié)果中排名靠前的靶點進(jìn)行分子對接，驗證LDGD中的藥效成分是否能與相關(guān)靶點結(jié)合。

從PDB(http://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫中得到以上靶點的晶體結(jié)構(gòu)，對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，后續(xù)的對接將使用預(yù)處理之后的蛋白結(jié)構(gòu)。

本研究中，將與蛋白晶體復(fù)合的原配體所在位點初步定義為活性口袋。為了驗證活性口袋的可靠性，先將原配體取出，使用Discovery Studio 2.5中的Libdock功能來將原配體和蛋白進(jìn)行對接，后選取打分值最高的構(gòu)象來和原配體本來的構(gòu)象進(jìn)行比對，采用計算均方根偏差(root-mean-square deviation，RMSD)的方法，將其結(jié)果作為活性口袋是否符合標(biāo)準(zhǔn)的參數(shù)。當(dāng)RMSD≤2.0?時，我們認(rèn)為用來進(jìn)行對接的活性口袋能夠良好的重現(xiàn)原配體的作用模式，并記錄原配體與蛋白晶體相互作用的關(guān)鍵氨基酸以及打分值，并將原配體打分值的80%設(shè)置為閾值[15]。當(dāng)RMSD＞2.0?時，調(diào)整活性口袋的坐標(biāo)，直到RMSD≤2.0?。在確定活性口袋的坐標(biāo)后，將事先準(zhǔn)備好的中藥小分子與上述靶標(biāo)進(jìn)行對接，并按照原配體打分值的80%和與原配體相互作用的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 甘草干姜湯的化學(xué)成分及靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集甘草干姜湯中101個在TCMSP中符合類藥篩選或在甘草、干姜中有報道的成分，將收集的成分對應(yīng)的靶點進(jìn)行合并去重處理后，共得到LDGD成分相關(guān)靶點220個。

2.2 藥物靶點和疾病靶點的Venn圖繪制

LDGD成分相關(guān)靶點有220個；利用Genecards數(shù)據(jù)庫收集到499個疾病靶點，兩者取交集共得到88個交集靶點，結(jié)果如圖1所示，后續(xù)會利用交集靶點進(jìn)行分析。

圖1 LDGD化學(xué)成分和乳腺癌關(guān)鍵靶點Venn圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

運用Cytoscape 3.8.0中的Import Network插件構(gòu)建甘草干姜湯化學(xué)成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及LDGD抗乳腺癌關(guān)鍵靶點篩選

將從2.2中獲得的88個交集基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，把得到的string_interactions.txt文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0，使用Network Analyse插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，節(jié)點代表靶蛋白，邊代表靶蛋白與靶蛋白之間的作用關(guān)系，見圖3。LDGD抗乳腺癌核心靶點篩選指標(biāo)：介度中心性(betweenness centrality)，緊密中心性(closeness centrality)，節(jié)度中心性(degree centrality)，特征向量(eigenvector centrality)，局部連通性(local average connectivity-based method)。篩選條件：應(yīng)用R軟件的在線程輯包，對各交集基因的上述篩選指標(biāo)數(shù)值進(jìn)行測算，各組數(shù)值中大于本組中位值的基因予以保留，運行R腳本，篩選核心靶點，將篩選結(jié)果按照Degree數(shù)值進(jìn)行排序，篩選出的20個LDGD抗乳腺癌核心靶點結(jié)果如表1所示。

圖2 LDGD化學(xué)成分和癌癥靶點的作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 LDGD抗乳腺癌作用潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 LDGD抗乳腺癌核心靶點拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

LDGD抗乳腺癌核心靶點中關(guān)鍵靶點的進(jìn)一步篩選流程見圖4，將每次PPI網(wǎng)絡(luò)中大于中位值的靶點再進(jìn)按照上述步驟對核心靶點進(jìn)行篩選，共3次，從圖中結(jié)果可知LDGD抗乳腺癌的關(guān)鍵靶點為AKT1、MYC、TP53、EGF。

圖4 LDGD抗乳腺癌關(guān)鍵靶點的篩選

2.5 交集基因的GO功能富集分析

選取排名前10的富集條目，并根據(jù)每個項目的P值、Q值及富集在其上的基因數(shù)目繪制條形圖。結(jié)果如圖5所示，LDGD抗乳腺癌的功能富集分析結(jié)果共得到2 569個GO條目。細(xì)胞成分45個，主要有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、質(zhì)膜筏、核染色質(zhì)、蛋白激酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、膜區(qū)、膜微區(qū)等。生物學(xué)過程2 218個，主要有凋亡信號通路的調(diào)節(jié)，氧化應(yīng)激等。分子功能130個，主要有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性核受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合等。

圖5 甘草干姜湯抗乳腺癌的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

使用R語言的“Pathview”在線程輯包，對交集基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。選取排名前20的富集通路，根據(jù)每個通路的P值、Q值及富集在其上的基因數(shù)目繪制氣泡圖，見圖6。

如圖6所示，LDGD抗乳腺癌主要涉及p53、TNF、IL-17、EGFR、細(xì)胞凋亡等信號通路。

圖6 LDGD抗乳腺癌的KEGG通路富集圖

2.7 分子對接結(jié)果

以AKT1為關(guān)鍵詞檢索PDB數(shù)據(jù)庫，獲得一個蛋白晶體結(jié)構(gòu)，PDB編號為4EKL，分辨度為2.00?(表2)。以原配體所在位置設(shè)置活性口袋，口袋的三維坐標(biāo)為28.219 521，5.262 347，11.381 138，半徑為9.493 813。原配體打分值為142.655，RMSD值為0.744 1。關(guān) 鍵 氨 基 酸 為GLU234，GLU228，GLY159，ALA230。8種成分與活性口袋進(jìn)行對接，甘草苷、6-姜酚、6-姜烯酚、甘草素、異甘草素、異甘草苷能與活性口袋完成對接(圖7)。以原配體打分值的80%為標(biāo)準(zhǔn)：甘草苷、6-姜酚、6-姜烯酚、甘草素均符合對接標(biāo)準(zhǔn)，且均能與關(guān)鍵氨基酸GLU234產(chǎn)生氫鍵或靜電作用。MYC未找到合適的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，TP53、EGF均未找到與蛋白晶體結(jié)構(gòu)對應(yīng)的原配體，因此未列出結(jié)果。

表2 甘草干姜湯8種藥效成分與AKT1分子對接結(jié)果

圖7 甘草干姜湯藥效成分與靶點AKT1的結(jié)合方式

3 討論

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在篩選出甘草干姜湯抗乳腺癌可能的藥效成分和作用機制，結(jié)果表明LDGD抗乳腺癌的潛在關(guān)鍵靶點為AKT1、MYC、TP53、EGF；利用GO功能富集分析LDGD抗乳腺癌的生物學(xué)過程主要有凋亡信號通路、氧化應(yīng)激等，與分子功能相關(guān)的有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性核受體活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合等；通過KEGG通路富集分析LDGD抗乳腺癌主要涉及p53、TNF、IL-17、EGFR、細(xì)胞凋亡等信號通路；與AKT1進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示甘草苷、6-姜酚、6-姜烯酚、甘草素與靶點結(jié)合較好且打分值較高，并且研究報道甘草苷和6-姜酚在甘草干姜湯中含量較高，為175.68、29.48μg/mL[10]，因此這4種成分可能是抗乳腺癌主要活性成分。

由研究報道可知AKT有關(guān)通路可發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)翻譯和代謝等作用[16]，原癌基因c-MYC控制細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡之間的平衡[17]，p53通過介導(dǎo)增強子調(diào)控參與乳腺癌通路[18-19]，EGF可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[20]。而中藥復(fù)方抗腫瘤是一個多靶點多成分共同作用的結(jié)果，本文從“疾病-基因-靶點-藥物”的角度出發(fā)，預(yù)測了甘草干姜湯抗乳腺癌可能的藥效成分和作用機制。但研究結(jié)果受限于中藥成分和疾病靶點的研究報道，比如甘草干姜湯藥效成分的研究尚有不足，靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)不準(zhǔn)確或沒有原配體等可能導(dǎo)致其抗腫瘤作用成分預(yù)測的準(zhǔn)確性有所欠缺。應(yīng)結(jié)合實驗研究和臨床研究進(jìn)一步優(yōu)化靶點選擇，綜合考慮藥效成分及其含量、與靶點的結(jié)合情況等確定主要活性成分，為實驗研究提供指導(dǎo)。