李昕葦，王全凱，馬順鵬，王 苗，烏瀚寶櫟爾，顧軼婷，康同影，許建寧，*

（1．中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050；2．中國疾病預(yù)防控制中心化學污染與健康安全重點實驗室，北京 100050）

甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸縮水甘油酯，主要在丙烯酸粉末涂料、乳膠涂料、膠粘劑的合成和加工中被廣泛使用。目前國際癌癥組織(International Agency for Research on Cancer，IARC)已完成對GMA的致癌性評估，根據(jù)“強有力”的致癌機制證據(jù)及“充分”的實驗證據(jù)，將GMA歸類為“對人類很可能致癌”(Group 2A)[1]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，在GMA誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，細胞基因組和表觀遺傳學發(fā)生異常改變，過程中涉及眾多細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并可能導(dǎo)致下游分子蛋白的一系列改變[2-4]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一種具有200多個核苷酸、未翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本，通常認為它是基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的限制調(diào)節(jié)因子，然而，隨著研究的深入，LncRNA逐漸受到覆舟關(guān)注，亦發(fā)現(xiàn)它們具有翻譯調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能[5]。競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)是LncRNA通過結(jié)合微小RNA(microRNA，miRNA)應(yīng)答元件競爭性吸附miRNA，抑制miRNA與信使RNA(message RNA，mRNA)結(jié)合，從而導(dǎo)致靶基因沉默[6]，其中，LncRNA與mRNA之間存在正調(diào)控關(guān)系，與miRNA存在負調(diào)控關(guān)系[7]。因此本次試驗對GMA誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化不同時期差異表達的LncRNA進行檢測分析，并以此為依據(jù)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對差異表達的LncRNA功能進行預(yù)測和分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

GMA(純度≥98.5%)和二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司(美國)；胰蛋白酶、EDTA-Na2購于Amresco公司(美國)；MEM培養(yǎng)基粉購于Hyclone公司(美國)；標準胎牛血清購于Gibco公司(美國)；100×的青、鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2×PCR master mix購于Arraystar公司(美國)。

本研究使用的主要儀器有：CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；臺式高速低溫離心機(BECKMAN公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；紫外可見分光光度計(UNICO公司，美國)；7900HT Fast Real-Time PCR儀(Biosystems公司，美國)；ND-1000分光光度計(NanoDrop公司，美國)；ViiA 7實時定量PCR反應(yīng)體系(Applied Biosystems公司，美國)。Arraystar Human LncRNA Microarray V4.0芯片技術(shù)服務(wù)和引物設(shè)計及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的技術(shù)支持由上?？党缮锕咎峁?/p>

1.2 細胞培養(yǎng)

人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells，16HBE)來自美國加利福尼亞大學，將凍存于液氮中的細胞復(fù)蘇后，用質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋白酶消化后，用10%標準胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜?；谡n題組既往關(guān)于GMA的細胞毒性和克隆形成率的研究結(jié)論，選擇濃度為8μg/mL的GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[8]。取對數(shù)生長期的細胞進行接種，24 h后向培養(yǎng)液中加入濃度為8μg/mL的GMA進行染毒(DMSO作為對照)。每次染毒時間72 h，間隔24 h后進行2次染毒，重復(fù)染毒3次后結(jié)束染毒，記為第1代；MEM培養(yǎng)液調(diào)整為5%FBS繼續(xù)培養(yǎng)，每隔5 d傳代1次。課題組既往研究[9]表明，傳代培養(yǎng)至第30代，GMA染毒組的16HBE細胞具備惡性轉(zhuǎn)化細胞的生物學特性。根據(jù)課題組既往ConA凝集試驗及錨著非依賴性試驗的研究結(jié)果，選擇收取第10、20和30代的GMA染毒組細胞和DMSO對照組細胞，記為轉(zhuǎn)化前(P10)、中(P20)和后期(P30)。

1.3 LncRNA芯片分析

收集GMA處理組和DMSO對照組的P10、P20和P30細胞，TRIzol提取總RNA，使用NanoDrop-1000分光光度計檢測RNA濃度和純度，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肁rraystar RNA Flash標記試劑盒標記總RNA樣品，再使用Agilent SureHyb進行雜交實驗，完成雜交后洗滌芯片，采用Agilent DNA Microarray Scanner掃描芯片的信號值，標準化處理后得到不同時期細胞LncRNA表達譜。

最后，通過人工檢索GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中P10、P20和P30代細胞LncRNA表達譜的差異性表達結(jié)果，以3個時期差異倍數(shù)的對數(shù)絕對值|log2FC|≥2.0且P＜0.05為標準篩選得到在不同時期表達水平均上調(diào)的LncRNA，確定GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程及其不同時期涉及的相關(guān)LncRNA。

1.4 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)根據(jù)miRNA建立調(diào)控關(guān)系，因此以表達水平具有上調(diào)趨勢的LncRNA為中心，通過TargetScan和miRanda數(shù)據(jù)庫進行差異性表達LncRNA靶基因的預(yù)測[10-11]，根據(jù)超幾何檢驗來驗證LncRNA與mRNA之間是否存在ceRNA關(guān)系及其顯著性差異，公式如下：

經(jīng)過篩選后得到P＜0.05的ceRNA對用于構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)工具Cytoscape構(gòu)建GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 實時熒光定量PCR驗證LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116的表達水平

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)將已提取的P10、P20和P30代細胞的總RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)反應(yīng)，引物序列見表1。qPCR體系(10μL)：2×Master Mix 5μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板2μL及無核酸酶水2μL；擴增條件為：95℃，預(yù)變性10 min；95℃，變性10 s；60℃，退火60 s，40個PCR循環(huán)。以管家基因βactin為內(nèi)參，同期DMSO對照組基因的平均值為基準，以GMA組基因表達量除以樣品內(nèi)參基因表達量，得到的比值即所驗證的LncRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析，LncRNA相對表達量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中LncRNA芯片的篩選結(jié)果

對GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中P10、P20和P30代細胞LncRNA芯片結(jié)果進行分析，篩選得到在不同時期表達水平均上調(diào)的LncRNA共16個，見圖1，差異性表達LncRNA變化情況如表2所示。其中惡性轉(zhuǎn)化的P20細胞中AP000619.5、CTA-384D8.35及G071314表現(xiàn)尤為明顯，與同代齡DMSO溶劑對照組相比上調(diào)超過10倍。

圖1 GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達水平一致性上調(diào)的LncRNA

表1 qPCR測定的引物序列

表2 第10、20、30代染毒組細胞中表達一致性上調(diào)的LncRNA

2.2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和功能富集分析

通過TargetScan和miRanda數(shù)據(jù)庫預(yù)測GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中差異表達的16個LncRNA的目標靶向mRNA和miRNA，二者結(jié)果取交集后，進行超幾何分析并計算ceRNA對之間表達量的Pearson相關(guān)系數(shù)＞0.9，最終篩選出3個關(guān)鍵的差異表達LncRNA，32個mRNA和204個miRNA，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2。構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)合hub基因評分，發(fā)現(xiàn)LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116可能通過LncRNA G013234-hsamiR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsamiR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1調(diào)控軸在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用。

2.3 LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116相對表達量的檢測結(jié)果

綠色圓形：LncRNA；藍色圓形：mRNA；紅色圓形：miRNA.

表3 qPCR檢測不同時期16HBE細胞LncRNA相對表達水平

對構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵差異表達LncRNA進行qPCR檢測，結(jié)果見表3。與同代齡DMSO對照組相比，GMA組細胞LncRNA G013234、CTA-384D8.35和G087116相對表達量在P10、P20和P30代細胞中均上調(diào)。除G087116在P10代細胞中表達量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余LncRNA的相對表達量在兩組間差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。qPCR檢測結(jié)果顯示細胞不同時期LncRNA相對表達水平的變化趨勢與芯片檢測結(jié)果一致。

3 討論

LncRNA是一類進化保守的非編碼RNA，參與細胞表觀遺傳調(diào)控、周期調(diào)控、分化調(diào)控等過程，同時LncRNA可能包含未被發(fā)現(xiàn)的細胞惡性轉(zhuǎn)化驅(qū)動因子。LncRNA可以通過RNA-蛋白質(zhì)，RNA-RNA和RNA-脂質(zhì)相互作用，在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)作用[12]。本研究主要研究在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)差異表達LncRNA的篩選及表達改變，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討LncRNA在16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中可能存在的生物學作用。

本研究采用GMA重復(fù)染毒誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化，根據(jù)P10、P20和P30代細胞的芯片檢測結(jié)果，篩選在細胞惡性轉(zhuǎn)化不同時期差異表達的LncRNA，共發(fā)現(xiàn)16個LncRNA在不同時期表達均發(fā)生上調(diào)，以差異性表達上調(diào)的LncRNA為基礎(chǔ)構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含3個關(guān)鍵的差異表達LncRNA即G013234、CTA-384D8.35及G087116，32個mRNA和204個miRNA。在PubMed、萬方、中國知網(wǎng)等文獻數(shù)據(jù)庫中檢索上述關(guān)鍵差異表達LncRNA的相關(guān)文獻，并在NCBI、Ensemble等數(shù)據(jù)庫中查詢這些LncRNA相關(guān)注釋信息，發(fā)現(xiàn)LncRNA G013234、CTA-384D8.35及G087116可以檢索到參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究及相關(guān)文獻。后經(jīng)qPCR檢測ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中LncRNA在細胞惡性轉(zhuǎn)化不同時期的相對表達量，檢測結(jié)果與芯片結(jié)果一致，進一步說明上述LncRNA可能在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。

CeRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為LncRNA和mRNA之間更復(fù)雜精細的調(diào)控提供了假說，也為研究LncRNA在細胞內(nèi)的功能及與其他編碼、非編碼RNA的相互作用提供了新的思路[13]。在本研究構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129，LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD，LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1這3個調(diào)控軸是與GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程關(guān)聯(lián)較為密切的ceRNA三元組(P＜0.05)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)組織中CTA-384D8.35表達與IL-6呈正相關(guān)，同時CTA-384D8.35直接結(jié)合IL-6啟動子，激活I(lǐng)L-6轉(zhuǎn)錄，并上調(diào)IL-6表達和分泌以激活PDAC細胞中STAT3信號通路；且胰腺導(dǎo)管腺癌中PanIN-3病變部位miRNA hsa-miR-486-3p發(fā)生異常過表達[15]。目前有研究表明，hsa-miR-486-3p在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的血液中異常表達且富集到靶基因產(chǎn)物STAT3[16]。而Xu等[17]發(fā)現(xiàn)LYPD可通過抑制IL-6和TNF-α的分泌來調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移，并且TNF-α和IL-6的分泌與STAT3和P65的磷酸化呈正相關(guān)。因此，LncRNA CTA-384D8.35可能通過與hsa-miR-486-3p的相互作用調(diào)節(jié)細胞因子IL-6的表達，進而影響STAT3信號通路的傳導(dǎo)，導(dǎo)致LYPD在GMA誘導(dǎo)16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中的分泌改變，從而影響細胞的增殖和遷移等活動。

有研究表明has-miR-378在膽管癌中可作為癌基因發(fā)揮作用，促進膽管癌細胞增殖、遷移和侵襲[18]，且has-miR-378參與骨肉瘤的發(fā)生及其肺轉(zhuǎn)移的生物學過程[19]。TMEM129是非糖基化蛋白，包含一個非剪切信號錨定序列，可用于催化分泌蛋白細胞質(zhì)降解所需的泛素化反應(yīng)[20]；而TMEM129所涉及的DNA甲基化過程也與黃種人和白種人的早期肺腺癌的預(yù)后有關(guān)[21]。上述研究表明，LncRNA G01323可能調(diào)節(jié)TMEM129所涉及的DNA甲基化過程，從而激活原癌基因has-miR-378b，在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

Zhang等[22]的研究表明，miR-29b-3p通過下調(diào)TRAF3促進MDA-MB-231三陰性乳腺癌細胞的進展。NAV1是一種主要在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的蛋白，為電壓門控鈉離子通道，據(jù)報道在微管發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。亦有文獻報道其在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞中出現(xiàn)異常表達，如Luo等[24]研究顯示，Nav1以電壓門控鈉通道的形式在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中異常激活和表達，從而增強乳腺癌細胞在體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移和侵襲性。Papadopoulos等[25]的研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻的體外試驗中，NAV1遵循經(jīng)典的調(diào)控模式，即miR-29b-3p的上調(diào)導(dǎo)致靶標NAV1的下調(diào)，證實NAV1可能是miR-29b-3p的直接靶點；同時有報道指出，根據(jù)時間和條件的改變，miRNA可能與誘導(dǎo)其靶標mRNA的調(diào)控方向相同，這亦為miR-29b-3p調(diào)控NAV1可能的間接機制提供了解釋[26]。因此，LncRNA G087116可能通過調(diào)節(jié)miR-29b-3p的表達導(dǎo)致NAV1的表達改變，從而參與GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化過程。

本研究通過LncRNA芯片分析和qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化不同時期細胞中LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116發(fā)生表達上調(diào)。以上述差異表達LncRNA為基礎(chǔ)構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及預(yù)測得到GMA誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的關(guān)鍵mRNA，篩選出LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1調(diào)控軸，并且這些調(diào)控軸可能在GMA誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮重要作用。