孟勝喜，陳慧澤，劉 雨，王 兵，李文濤，潘衛(wèi)東，張云云

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征為β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)以老年斑的形式在細胞外的蓄積和過度磷酸化tau蛋白以神經(jīng)原纖維纏結的形式在細胞內(nèi)蓄積，從而呈現(xiàn)進行性神經(jīng)元丟失和腦萎縮[1-5]。AD嚴重威脅病人的日常生活質(zhì)量，給病人家庭和社會帶來了沉重的照顧負擔和經(jīng)濟負擔。目前還沒有改善AD的有效治療方法[6]。中醫(yī)藥在防治AD方面發(fā)揮著不可替代的作用，其優(yōu)勢也逐漸被重視和關注[7]。恒清Ⅱ號方(HQ)是本課題組長期用于臨床防治AD療效確切的經(jīng)驗方，前期做過大量相關的臨床試驗和動物實驗研究，已經(jīng)驗證了恒清Ⅱ號方對于AD具有確切的療效[8-11]，且已申請了國家專利(專利號：201910371018.5)，但是其作用機制仍需要進一步深入研究。鑒于此，本研究以淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠為AD動物模型，探討恒清Ⅱ號方對其作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性24周齡APP/PS1雙轉基因小鼠，體質(zhì)量(27±2)g，無特定病原體(SPF)級，由南京大學模式動物研究所提供，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001；雄性24周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(26±3)g，SPF級，購買于上海靈暢生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-003。

1.2 藥物、試劑與儀器

1.2.1 藥物 恒清Ⅱ號方組成：益智仁30 g，黃芪15 g，菟絲子10 g，川芎10 g，熟地黃15 g，桑寄生10 g，煅石決明10 g，杜仲10 g，地龍10 g，天麻10 g，鉤藤10 g。由上海市第六人民醫(yī)院中藥房提供。按以上恒清Ⅱ號方處方比例稱取全部藥材，加入10倍量的水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，過濾，合并以上3次濾液，在37 ℃水浴中加熱濃縮，根據(jù)臨床實際用藥情況，對所得藥液進行濃縮處理，濃縮至0.535 g/mL匹配臨床的實際用藥濃度，置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 主要試劑與儀器 PI3 Kinase p85(19H8)Rabbit mAb(CST公司，美國)，Akt Antibody(CST公司，美國)，Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XP?Rabbit mAb(CST公司，美國)，mTOR(S2442)polyclonal antibody(Bioworlde公司，美國)，Phospho-mTOR(Ser2448)(D9C2)XP?Rabbit mAb(CST公司，美國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012S，上海碧云天生物技術有限公司，中國)，anti-β-actin(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)，二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)。Morris全自動水迷宮測試系統(tǒng)購自上海吉量軟件科技有限公司(型號：JLBehv-MWMG-1)。

1.3 分組及給藥 按照隨機數(shù)字表法將20只雄性24周齡APP/PS1雙轉基因小鼠隨機分為模型組、HQ 組，每組10只，同時另設立同周齡、同背景的C57BL/6小鼠10只為正常對照組。HQ 組小鼠每天給予HQ 40 mg/kg灌胃，正常對照組和模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，均為每日1次，連續(xù)灌胃8周。然后進行Morris水迷宮實驗檢測。

1.4 觀察指標

1.4.1 Morris水迷宮實驗評價APP/PS1小鼠學習記憶能力與空間位置認知能力 Morris水迷宮實驗連續(xù)進行5 d，前4 d(定位航行實驗)將實驗小鼠分別從3個不同的入水點面朝池壁依次置于水中，依次記錄每只小鼠的逃避潛伏期(escape latencies，EL)、游泳路徑長度。第5天(空間探索實驗)，先撤去平臺，將小鼠于同樣的3個入水點依次置于水中，依次記錄小鼠在90 s內(nèi)跨越平臺的次數(shù)(number of cross-platform，NCP)[12]。計算機攝像系統(tǒng)自動監(jiān)測Morris水迷宮實驗水池中的小鼠游泳情況，然后采用軟件對相關數(shù)據(jù)進行處理。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測小鼠海馬組織磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinases，PI3K)、蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)、磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表達水平 灌胃8 周后，用0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，斷頭，冰盤上開顱取腦，分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。檢測時取出小鼠海馬組織，加RIPA裂解緩沖液，研磨均勻，冰上30 min，取上層液，4 ℃離心15 min(12 000 r/min)，提取總蛋白，測蛋白濃度。每組蛋白上樣40～60 μg，電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，過夜后，二抗孵育，掃描，圖像導出，采用Image J軟件分析。

2 結 果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果比較

2.1.1 定位航行實驗 第1天至第4天，與正常對照組比較，模型組小鼠的EL均明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；第1天、第2天，與模型組比較，HQ 組小鼠EL均縮短，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第3天、第4天，與模型組比較，HQ 組小鼠EL均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組小鼠EL比較 (±s) 單位：s

第1天至第4天，與正常對照組比較，模型組小鼠的定位航行路徑長度均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；第1天、第2天，與模型組比較，HQ組小鼠定位航行路徑長度縮短，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第3天、第4天，與模型組比較，HQ 組小鼠定位航行路徑長度均明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組小鼠定位航行路徑長度比較 (±s) 單位：m

2.1.2 空間探索實驗 與正常對照組比較，模型組小鼠NCP明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ 組小鼠NCP明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表3。

表3 各組小鼠NCP比較(±s) 單位：次

2.2 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平比較 與正常對照組比較，模型組小鼠海馬組織 PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ組小鼠PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖1、表4。

圖1 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(1為正常對照組；2為模型組；3為HQ組)

表4 各組小鼠海馬組織PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平比較 (±s)

3 討 論

自噬可減少Tau蛋白的過度磷酸化延緩AD進展。在AD病人中線粒體自噬增加，自噬與神經(jīng)炎性反應之間有著密切的聯(lián)系。目前已知PI3K/Akt/mTOR是細胞自噬的重要轉導通路，其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的凋亡和自噬管理著細胞的存活。抑制PI3K/Akt/mTOR則可以誘導自噬，而自噬可能對細胞產(chǎn)生保護作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路異常激活與AD的病理學改變有關[13]。PI3K和其下游分子Akt所構成的信號途徑作為一個經(jīng)典抗凋亡、促存活的信號傳導途徑，通過激活下游mTOR來調(diào)節(jié)自噬[14]；PI3K的下游直接靶點蛋白Akt調(diào)節(jié)細胞代謝和存活，PI3K的激活可使Akt磷酸化[15]，而激活后的Akt蛋白可以啟動通路下游的級聯(lián)反應，可以進一步磷酸化一系列下游底物，通過多種機制促細胞存活、抗細胞凋亡[16]；mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是控制細胞生長、增殖、代謝和凋亡的關鍵調(diào)節(jié)物[17]，也是PI3K信號通路下游分子之一。

AD在中醫(yī)學中屬“呆病”“善忘”“癡呆”“健忘”等范疇。清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯·腦髓說》提出，腎虛、腦髓失養(yǎng)是本病的主要病因?！秱摗返摹捌淙松仆?，必有蓄血”以及清末名醫(yī)唐容川的 “凡心有瘀血，亦令健忘”“血在上，則濁蔽不明矣”(《血證論》)，均提示瘀血是癡呆的重要形成因素。明代醫(yī)藥學家李時珍的“痰生百病”(《頻湖脈學》)，痰迷神竅可致癡呆。清代醫(yī)家陳士鐸的“治呆無奇法，治痰即治呆”(《辨證錄》)。 痰飲和瘀血相互影響，痰可致瘀，瘀也可成痰。痰瘀互結，元神失養(yǎng)，則生本病。因此，AD的病機根本為腎虛，病機關鍵在痰瘀，治療上應以補腎為主，輔以化痰祛瘀。恒清Ⅱ號方是本課題組根據(jù)長期臨床觀察總結而來的治療AD的經(jīng)驗效方，全方具有補腎、化痰祛瘀的作用，從而治療AD[8-11]。

益智仁的主要成分諾卡酮對腦室內(nèi)注射脂多糖(LPS)誘發(fā)的AD小鼠模型具有較好的神經(jīng)保護作用[18]。黃芪的主要成分黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ， AS-Ⅳ)作為一種天然的過氧化物酶體增殖活化受體(PPARγ)可抑制Aβ1-42誘導的APP/PS1小鼠的記憶障礙和海馬神經(jīng)細胞凋亡，可能是通過促進PPARγ/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號通路而引起的[19]，也可以減輕Aβ1-42誘導的氧化應激、神經(jīng)炎癥、線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放[20-21]。菟絲子提取物可以改善衰老模型小鼠的學習記憶能力[22]。川芎揮發(fā)油中的主要成分丁基苯酞則可通過調(diào)節(jié)Akt、 信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)信號通路等[23]，從而抗神經(jīng)細胞凋亡、抗腦缺氧、增強認知能力等。熟地黃可抑制血漿皮質(zhì)醇含量和海馬糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達，提高學習記憶能力，上調(diào)海馬神經(jīng)生長因子、c-fos的基因表達[24]。小鼠Morris水迷宮實驗和被動回避實驗表明桑寄生可以逆轉東莨菪堿所致的記憶障礙[25]。牡蠣水提液可以延緩去卵巢大鼠腦衰老[26]。杜仲對受到脂多糖刺激的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞BV-2具有抗炎活性[27]。地龍?zhí)崛∫嚎汕宄?MDA)、超氧化物歧化酶，阻斷Ca2+內(nèi)流，保護缺血再灌流損傷[28]。天麻的主要有效成分巴利森苷C可以改善Aβ1-42誘導的大鼠腦損害后長時程增強抑制，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導電流[29]。鉤藤水提物、異鉤藤堿可以改善Aβ蛋白變性導致的神經(jīng)細胞損傷[30]。

本研究結果顯示，第1天至第4天，與模型組比較，恒清Ⅱ號方組小鼠EL、定位航行路徑長度均明顯縮短，NCP明顯增加(P<0.01)，表明恒清Ⅱ號方可以明顯改善AD小鼠的學習記憶能力。與正常對照組比較，模型組小鼠的海馬腦區(qū)PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，HQ組小鼠的海馬腦區(qū)PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平均降低(P<0.05)，其中，不僅Akt和mTOR總量表達下降，p-Akt和p-mTOR水平也明顯降低，表明自噬效應明顯增強。表明恒清Ⅱ號方可以有效抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，Western Blot檢測結果也表明自噬現(xiàn)象明顯增強。說明恒清Ⅱ號方可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，增強自噬。

綜上所述，恒清Ⅱ號方可以改善APP/PS1小鼠的學習記憶功能，可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路、增強自噬而發(fā)揮抗AD作用的。