趙瑞彪，單會艷，俞艷華

心肌梗死是臨床常見的心血管疾病，近年來，心肌梗死發(fā)病率與死亡率逐年上升，已嚴重影響人們生活質量，非編碼RNA屬于組織特異性的RNA分子，其具有高度保守性，并可調控細胞增殖及凋亡等過程從而參與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程，其中，微小RNA(miRNA)與長鏈非編碼RNA(LncRNA)在心血管疾病中表達異常，并可能作為減輕心肌細胞損傷的治療靶點[1-5]。長鏈非編碼RNA SNHG7(LncRNA SNHG7)在骨關節(jié)炎中表達水平降低，上調其表達可抑制軟骨細胞凋亡及促進細胞增殖[6]。但SNHG7在小鼠心肌梗死后心肌細胞損傷中的作用機制尚未闡明。本研究旨在探討SNHG7過表達對小鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及炎癥損傷的影響及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 40只無特定病原體(SPF)級C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，12周齡，死亡4只，剩余36只，動物許可證號SXCK(京)：2016-0008。大鼠心肌細胞H9C2購自美國ATCC細胞庫；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miR-223 mimics、miR-NC、si-NC、si-SNHG7購自上海吉瑪制藥技術有限公司；Trizol、cDNA合成、熒光定量購自美國Thermo Fisher公司；缺口末端標記法(TUNEL)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠脂肪酸合成酶(Fas)、Cleaved Caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠心肌梗死模型 采用2%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉小鼠，切開氣管，使用呼吸機輔助呼吸(7～8 mL)，120次/min，呼吸比1∶2，在第4肋間入胸，識別前降支走行范圍，采用滑線(7/0)結扎前降支，同時進行蘇木素-伊紅(HE)染色與Masson染色，觀察小鼠心電圖示波，若左心室前壁部分顏色轉為蒼白且具有心肌梗死的臨床表現(xiàn)時則視為模型制作成功[7]。1.2.2 實驗分組 采用慢病毒方法構建攜帶SNHG7過表達的慢病毒與攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒空載體[8]。36只小鼠隨機選取9只作為假手術組(小鼠僅開胸，不結扎冠狀動脈)，其余27只小鼠均進行造模，隨機分為模型組、空載組與SNHG7過表達組，每組9只?？蛰d組攜帶GFP的慢病毒空載體(4×107TU)進行心肌組織局部注射轉染，SNHG7過表達組攜帶SNHG7過表達的慢病毒(4×107TU)進行心肌組織局部注射轉染。各組培養(yǎng)24 h后，采用10%水合氯醛麻醉小鼠，切取遠端缺血心肌組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.2.3 缺氧/缺血誘導H9C2細胞建立細胞損傷模型 H9C2細胞正常培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)基，首先置于缺氧罐內，同時在其中放置Genbox厭氧產氣包，制備缺血/缺氧模型，將缺氧罐置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗研究[9]。將正常培養(yǎng)的心肌細胞作為Con組，將缺氧缺血處理的心肌細胞作為缺氧組。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測SNHG7、miR-223與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β) mRNA的表達水平 采用Trizol法提取總RNA，反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增檢測SNHG7、miR-223與TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 取心肌組織，常規(guī)脫蠟處理制備石蠟切片(5 μm)，經過不同濃度的乙醇浸洗，滴加蛋白酶K溶液，室溫孵育，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，滴加50 μL TUNEL反應液，室溫孵育1 h，PBS洗滌，滴加過氧化氫10 min，PBS洗滌，滴加底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物溶液(50 μL)，室溫孵育10 min，PBS洗滌，加入DIPA，采用抗熒光淬滅劑封片，應用熒光顯微鏡觀察與藍色細胞核重疊的綠色熒光為凋亡細胞，凋亡指數(shù)=凋亡細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測SNHG7與miR-223的靶向關系 LncBase v.2預測顯示SNHG7與miR-223存在結合位點，分別構建野生型載體WT-SNHG7與突變型載體MUT-SNHG7，分別將miR-NC、miR-223 mimics與WT-SNHG7、MUT-SNHG7共轉染至心肌細胞，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，檢測各組相對熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-SNHG7、si-NC、si-SNHG7轉染至心肌細胞，采用qRT-PCR檢測miR-223的表達量。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達 心肌組織加入500 μL RIPA裂解液提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜、封閉2 h，孵育一抗稀釋液與二抗稀釋液，化學發(fā)光加強法(ECL)顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。Fas、Cleaved Caspase-3一抗稀釋比為1∶1 000，二抗稀釋比為1∶2 000，F(xiàn)as、Cleaved Caspase-3以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參計算Fas、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 HE染色與Masson染色結果 HE染色結果顯示，模型組大鼠心肌細胞肥大，排列紊亂，血管增生，細胞間質增寬；Masson染色結果顯示，模型組大鼠出現(xiàn)組織纖維化，不定性膠原纖維組織增生。詳見圖1。

圖1 HE染色與Masson染色結果

2.2 各組大鼠SNHG7表達水平比較 與假手術組比較，模型組SNHG7表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過表達組SNHG7表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠SNHG7表達水平比較(±s)

2.3 SNHG7過表達對大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過表達組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 Western Blot法檢測Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達電泳圖

表3 SNHG7過表達對大鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響 (±s)

2.4 SNHG7過表達對大鼠心肌梗死后心肌細胞炎性因子mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組、空載組比較，SNHG7過表達組TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 SNHG7過表達對大鼠心肌梗死后心肌細胞炎性因子mRNA表達的影響 (±s)

2.5 缺氧/缺血誘導的H9C2細胞中SNHG7與miR-223的表達水平 與Con組比較，缺氧組SNHG7表達水平明顯降低(P<0.05)，miR-223表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見表5。

表5 缺氧/缺血誘導的H9C2細胞中SNHG7與miR-223的表達水平 (±s)

2.6 SNHG7靶向調控miR-223 LncBase v.2預測顯示，SNHG7與miR-223存在結合位點，詳見圖3。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-223過表達可抑制野生型WT-SNHG7轉染細胞的熒光素酶活性(P<0.05)，但其對突變型MUT-SNHG7轉染細胞的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，詳見表6。與pcDNA組比較，pcDNA-SNHG7組miR-223表達水平明顯降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-SNHG7組miR-223表達水平明顯升高(P<0.05)。詳見表7。

圖3 SNHG7的序列中含有與miR-223p互補的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報告實驗(±s)

表7 SNHG7靶向調控miR-223的表達(±s)

3 討 論

LncRNA可參與心肌梗死等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程，調控細胞增殖及凋亡等生物學過程，并可通過競爭性結合miRNA而負向調控其表達從而參與細胞凋亡等過程[10-12]。但仍有部分LncRNA在心肌梗死后心肌細胞損傷中的作用機制尚未闡明。

SNHG7在神經膠質瘤、卵巢癌、宮頸癌等腫瘤中表達水平升高，并可促進腫瘤發(fā)生及發(fā)展[13-15]。但SNHG7在心肌梗死中的表達及其可能作用機制尚未闡明。本研究結果顯示，心肌梗死模型組小鼠心肌組織中SNHG7的表達水平降低，而SNHG7過表達組SNHG7的表達水平明顯升高，提示SNHG7在心肌梗死發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。心肌梗死發(fā)生后可加重心肌損傷，其中，心肌細胞凋亡是加重心肌損傷的重要原因，因此，減少心肌細胞凋亡成為減輕心肌損傷的重要措施，細胞凋亡過程與 Caspase級聯(lián)反應密切相關，Caspase-3屬于凋亡執(zhí)行因子，凋亡過程中Caspase-3被激活形成Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-3的表達水平可反映細胞凋亡情況，而Fas基因被活性氧激活后可啟動凋亡程序而激活Caspase-8、Caspase-3，從而促進細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，模型組凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高，而SNHG7過表達后凋亡指數(shù)及Fas、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯降低，提示SNHG7過表達可抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡。心肌梗死后炎癥也可參與心肌缺血性損傷，心肌炎癥反應在心功能障礙中發(fā)揮重要作用，減輕炎癥反應可減輕心肌損傷，其中，炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β可能是心肌缺血后心功能障礙的重要刺激因子，并可能是促進細胞凋亡的重要影響因素[17]。本研究結果顯示，心肌梗死后小鼠心肌組織中TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達水平明顯升高，而SNHG7過表達后TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表達水平明顯降低，提示SNHG7過表達可通過抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表達從而減輕心肌炎性反應。

miR-223屬于髓系特異性miRNA，其在心血管疾病中表達異常，并可能通過調控內皮細胞的多種基因表達參與動脈粥樣硬化、心肌代謝等多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程[18]。miR-223在心肌梗死病人血清中的表達水平明顯升高，并可能作為預測心肌梗死的輔助指標，同時通過體外細胞實驗證實miR-223可促進心肌細胞凋亡[19]。大黃素通過下調miR-223的表達而減輕脂多糖誘導的心肌細胞損傷[20]。與上述研究結果相似，本研究通過體外細胞實驗證實缺氧/缺血誘導的心肌細胞中SNHG7的表達水平明顯降低，miR-223的表達水平明顯升高。本研究證實SNHG7可靶向結合miR-223，并可負向調控miR-223的表達及活性。提示SNHG7可能通過下調miR-223的表達從而對心肌細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，SNHG7過表達可抑制小鼠心肌梗死后心肌細胞凋亡及炎癥反應，其作用機制可能與靶向調控miR-223的表達有關，SNHG7可能作為心肌梗死等心血管疾病診斷及治療的潛在靶點，但關于心肌細胞損傷過程中SNHG7如何調控miR-223表達及其下游靶基因表達尚不清楚，其具體作用機制仍需進一步探討。