張洪珍，衛(wèi)國(guó)羽，趙 微，胡安龍*

（1.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

農(nóng)藥分為內(nèi)吸性農(nóng)藥和非內(nèi)吸性農(nóng)藥。對(duì)于具有內(nèi)吸性的農(nóng)藥而言，農(nóng)藥分子進(jìn)入植物細(xì)胞有主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸。通常研究認(rèn)為農(nóng)藥以被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入植物細(xì)胞，而關(guān)于蠶豆葉原生質(zhì)體吸收草甘膦的試驗(yàn)結(jié)果證明，植物對(duì)草甘膦的吸收是被磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)[1]。春雷霉素（圖1），又稱春日霉素，其結(jié)構(gòu)由二碳側(cè)鏈、春雷胺和D-肌糖三部分組成[2]。該類抗生素是一種農(nóng)用、醫(yī)用抗生素，其能抑制氨酰-tRNA結(jié)合mRNA-核糖體蛋白復(fù)合體，阻止蛋白質(zhì)翻譯的起始，抑制菌絲生長(zhǎng)和造成細(xì)胞顆粒化，從而使得病原菌凋亡[3]。春雷霉素自研發(fā)以來(lái)，由于其高效低毒的特性，在亞洲和南美洲被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對(duì)稻瘟病、番茄葉霉病、馬鈴薯環(huán)腐病、黃瓜和西瓜細(xì)菌性角斑病等具有很好的防效[4]，在農(nóng)業(yè)病害防治中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于春雷霉素的研究主要集中在作用機(jī)制[5]、田間防效[6]、殘留[7]等方面，而對(duì)于春雷霉素在植株體內(nèi)的內(nèi)吸傳導(dǎo)特性和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究較少。

圖1 春雷霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

農(nóng)藥的主動(dòng)吸收及韌皮部輸導(dǎo)對(duì)防治作物根部和維管束病害、刺吸式口器害蟲(chóng)等有較大優(yōu)勢(shì)。前人研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦以主動(dòng)方式跨膜運(yùn)輸并進(jìn)入韌皮部向根部輸導(dǎo)，使其表現(xiàn)出優(yōu)良特性[8]。因此，探明農(nóng)藥分子在作物體內(nèi)吸收機(jī)理與傳導(dǎo)特性具有重要意義。本研究以番茄幼苗為研究對(duì)象，通過(guò)葉面和根部浸藥，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法探究了春雷霉素在植物體內(nèi)的吸收與傳導(dǎo)方式，以期揭示該藥劑的傳導(dǎo)特性與吸收機(jī)理，為后期該藥劑研發(fā)設(shè)計(jì)靶向輸導(dǎo)型農(nóng)藥分子提供依據(jù)，以及為田間科學(xué)合理施藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6470質(zhì)譜儀、ST16R冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；CPA225D電子天平，德國(guó)賽多利斯股份公司。

春雷霉素原藥（純度98%）、D-葡萄糖、根皮苷（純度98%），阿拉丁試劑有限公司；氰化羰基間氯苯腙（CCCP，純度98%）、N-丙基乙二胺（純度98%），天津希恩思生化科技有限公司；二硝基苯酚（DNP，純度98%），麥卡希試劑有限公司。以上均為市售國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。超純水，美國(guó)密立波公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 番茄培養(yǎng)方法及樣品前處理

精選適量飽滿的種子，于30℃條件下用無(wú)菌水浸種催芽24 h，然后將種子均勻撒播在土壤表面，覆土，用噴壺灑水浸濕土壤。室內(nèi)培養(yǎng)條件為室溫（25±2）℃，用加濕器使室內(nèi)濕度保持在85%左右，于光照、黑暗分別處理16、8 h。以培養(yǎng)3葉番茄幼苗為供試材料。稱取2.00 g勻質(zhì)化的番茄樣品（精確到0.01 g）于10 mL離心管中，加入4 mL提取溶液（V甲醇∶V水為9∶1），渦旋振蕩提取2～3 min；加入1 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，于4 000 r/min下離心5 min；取1 mL上清液至2 mL離心管中，加入30 mgN-丙基乙二胺（PSA），渦旋振蕩30 s，于12 000 r/min下離心5 min；取上層凈化液1 mL，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待用HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.2 春雷霉素向頂傳導(dǎo)試驗(yàn)

用超純水稀釋春雷霉素，使制劑質(zhì)量濃度分別為50、100、150 mg/L，用5 mL藥劑對(duì)每株番茄進(jìn)行根部灌根施藥，每個(gè)處理重復(fù)3次，以超純水處理為對(duì)照，于相同條件溫室培養(yǎng)。在施藥后3、6、12、24、32、48 h，整株取樣，取樣時(shí)將根部和莖葉部分開(kāi)，于-20℃保存，備用。

1.2.3 春雷霉素向基傳導(dǎo)試驗(yàn)

用超純水稀釋，使制劑質(zhì)量濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L，將番茄第2張葉片（共3張葉片，浸藥葉片即為中部葉片）浸于配制好的藥液中，除去浸藥葉，上下各有一片葉可取。用清水處理的番茄為對(duì)照，于相同條件下溫室培養(yǎng)。在噴藥后6、12、24、48、72 h整株取樣，取樣時(shí)將根部和莖葉部分開(kāi)，稱重并記錄，于-20℃保存，備用。

1.2.4 不同影響因子對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響

（1）用檸檬酸和氫氧化鉀將春雷霉素藥液pH值分別調(diào)至4、5、6、7、8、9，將番茄根部浸于不同pH值的春雷霉素藥液中；（2）分別在24℃與4℃下將番茄根部浸于藥液并分別于6、12、24 h取樣；（3）將番茄根 部 分 別 浸 入 含 有0.15、0.30、0.50 mmol/L的CCCP和0.5、1.0、1.5 mmol/L的DNP溶液中培養(yǎng)1 h，隨后轉(zhuǎn)移至春雷霉素藥液中培養(yǎng)后取樣；（4）將n春雷霉素∶nD-葡萄糖=1∶20、1∶200和1∶300，以及將n春雷霉素∶n根皮苷噴=1∶10、1∶20和1∶30的配制藥液分別用于番茄幼苗浸根培養(yǎng)，取樣。以上處理藥液最終濃度為150 mg/L、pH值為5（pH處理組除外），在溫室培養(yǎng)（溫度處理組除外）24 h后取番茄幼苗莖部。

1.3 檢測(cè)條件

液相條件：流速為0.35 mL/min；柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5μL；流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水（75%）；流動(dòng)相B為乙腈（25%）；ZORBAX HILIC Plus色譜柱（3.0 mm×50 mm，1.8μm）。質(zhì)譜電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；噴霧電壓（IS＋）為5 500 V；電噴霧離子源溫度（TEM）為320℃；霧化氣流量為310.275 kPa；碰撞室入口電壓（EP）為150 V；碰撞室出口電壓（CXP）為85 V；定量離子對(duì)為380.3/200.3（m/z）；定性離子對(duì)為380.3/112.1（m/z）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及添加回收試驗(yàn)

用超純水溶解純度98%的春雷霉素，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的母液，再用超純水稀釋成濃度分別為0.001 0、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3條件測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線?？瞻追褬悠分屑尤胍欢看豪酌顾貥?biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其添加水平分別為0.05、0.10、0.50 mg/kg，3次重復(fù)試驗(yàn)。按1.2.1方法進(jìn)行樣品前處理，按1.3條件測(cè)定，計(jì)算番茄各部位添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多次驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)結(jié)果，每組處理番茄數(shù)為10株，重復(fù)3次。使用DPS 10.0，Duncan法對(duì)試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度

由圖2可知，目標(biāo)檢測(cè)物保留時(shí)間為0.620 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=1.125 9x＋5.699 9，相關(guān)系數(shù)為0.994 1。由表1可知，在0.05、0.10、0.50 mg/kg添加水平下，春雷霉素在番茄樣品中的平均回收率為89%～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.00%～3.00%，均低于10.00%。按信噪比為3（S/N=3）計(jì)算檢出限，可得春雷霉素檢出限為0.003μg/L。結(jié)果表明，建立的方法線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度較高，適用于番茄樣品中春雷霉素的檢測(cè)。

圖2 春雷霉素在番茄各部位色譜圖

表1 春雷霉素在番茄各部位的添加回收率

2.2 根部施用春雷霉素在番茄植株中的吸收和傳導(dǎo)

如圖3所示，分別用50、100、150 mg/L春雷霉素處理番茄6 h后，在根部和莖部均能檢測(cè)到春雷霉素。用藥劑處理24 h后，3組不同濃度處理的葉片中檢測(cè)到目標(biāo)藥劑含量分別為3.91、9.16、38.46μg/L。根部的春雷霉素含量在3～24 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，24～48 h內(nèi)處于平衡狀態(tài)，可能因?yàn)樵谠摃r(shí)間段內(nèi)根部吸收的藥劑迅速向莖部和葉部輸送。處理48 h后，藥劑在根部的累積達(dá)到最大量；50、100 mg/L處理組中，莖部的春雷霉素含量在3～48 h內(nèi)差異不顯著，但用150 mg/L處理后，莖部的春雷霉素含量呈顯著上升趨勢(shì)；高濃度處理組葉部中春雷霉素的積累量上升較快，且在24～48 h內(nèi)也趨于穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，春雷霉素通過(guò)番茄幼苗根部吸收后向上傳導(dǎo)，并在植株各個(gè)部位累積。

圖3 不同濃度的春雷霉素在番茄幼苗中的吸收和分布

2.3 葉部施用春雷霉素在番茄植株中的吸收和傳導(dǎo)

由表2可知，將幼苗中部葉片用不同質(zhì)量濃度藥液浸泡6 h后，在中部葉片均能檢測(cè)到目標(biāo)藥劑，其含量分別為11.09、25.99、40.81μg/L，說(shuō)明春雷霉素在番茄葉片上具有良好的吸收特性。6～12 h在幼苗上部和下部葉片均未檢測(cè)到目標(biāo)藥劑，12 h后能檢測(cè)到微量的春雷霉素，可能是藥劑被葉片吸收后大部分都累積在番茄葉片的各個(gè)細(xì)胞及組織中，或是向下運(yùn)輸。藥劑處理12 h后均可在莖部及根部檢測(cè)到目標(biāo)藥劑，其中用1 500 mg/L處理葉片72 h后，春雷霉素在根部的累計(jì)含量可高達(dá)21.03μg/L。

表2 春雷霉素處理中部葉片后在番茄幼苗中的吸收和分布

以上結(jié)果表明，春雷霉素在番茄體內(nèi)既可通過(guò)由木質(zhì)部向上運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)外體轉(zhuǎn)運(yùn)，也可由韌皮部向下運(yùn)輸?shù)墓操|(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)，具有雙向運(yùn)輸?shù)奶匦浴?/p>

2.4 pH對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響

由圖4可知，春雷霉素吸收量隨著堿性增強(qiáng)而逐漸下降。pH值為5時(shí)，春雷霉素的最大吸收量為83.07μg/L，隨著pH值的升高吸收量降低，逐步降低至80.00、58.86、50.09、42.01μg/L，特別是pH值為9時(shí)直接下降到42.01μg/L，與pH值為5時(shí)的吸收量相差1.9倍，表明番茄吸收春雷霉素受酸堿性的影響。

圖4 pH值對(duì)番茄吸收春雷霉素影響

2.5 溫度對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響

如表3所示，2種不同溫度處理下，春雷霉素的吸收量都隨著時(shí)間的增加而升高，且都是在24 h吸收量最大，分別為25.90和81.46μg/L。相關(guān)研究表明，Q10值（24℃下的吸收量除以4℃下的吸收量）小于或大于2.0可作為判斷作物對(duì)農(nóng)藥的吸收與生物代謝是否有直接的聯(lián)系，還是屬于被動(dòng)物理過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)[9]。本研究中Q10值均大于2.0，表明番茄幼苗對(duì)春雷霉素的吸收屬于主動(dòng)運(yùn)輸。

表3 不同溫度條件下番茄幼苗莖部春雷霉素的吸收量

2.6 能量抑制劑對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響

DNP可抑制細(xì)胞產(chǎn)生能量；CCCP是一種解偶聯(lián)劑，會(huì)影響植物對(duì)化合物的吸收，能去除藥物在跨膜過(guò)程中的質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，這是判斷吸收過(guò)程是否需要能量的重要標(biāo)準(zhǔn)。由圖5可知，加了0.50 mmol/L的CCCP和DNP的處理與未加的空白對(duì)照相比，處理24 h后，藥劑吸收量由72μg/L分別下降至28、25 μg/L，均受到顯著抑制，抑制率分別達(dá)60.12%、60.28%，說(shuō)明番茄吸收春雷霉素需要能量。

圖5 能量抑制劑（CCCP、DNP）對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響（P＜0.01）

2.7 競(jìng)爭(zhēng)性底物對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響

D-葡萄糖進(jìn)入植物體細(xì)胞，必須有載體蛋白才能完成運(yùn)輸。當(dāng)藥劑和D-葡萄糖同時(shí)存在時(shí)，藥劑和D-葡萄糖同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)共用載體而影響藥劑的吸收。由圖6可知，加入D-葡萄糖后與空白對(duì)照相比，春雷霉素吸收量受到了明顯的抑制作用，從72μg/L降低至60、46、25μg/L。隨著D-葡萄糖配比量的升高，抑制效果增強(qiáng)，抑制率分別為16.67%、36.11%、65.28%。加入葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑根皮苷，春雷霉素吸收量也受到了顯著的抑制效果，分別降低至50、35、30 μg/L，抑制率分別為30.56%、51.39%、58.33%。隨著根皮苷濃度升高，抑制效果加強(qiáng)。上述結(jié)果表明，番茄對(duì)春雷霉素的吸收可能有單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。

圖6 競(jìng)爭(zhēng)性底物（D-葡萄糖、根皮苷）對(duì)番茄吸收春雷霉素的影響（P＜0.01）

3 結(jié)論與討論

本研究采用浸根浸葉法，通過(guò)在番茄幼苗根部和特定葉位施藥，分別研究了春雷霉素在番茄幼苗中的向頂和向基傳導(dǎo)能力，以及番茄幼苗對(duì)春雷霉素的吸收機(jī)理。結(jié)果表明，春雷霉素具有較好的內(nèi)吸性和傳導(dǎo)能力，于番茄幼苗根部施藥后，可被根部快速吸收并向地上部分傳導(dǎo)，6 h后即可到達(dá)植株葉部；根部中春雷霉素含量在3～24 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，24～48 h內(nèi)處于平衡狀態(tài)。通過(guò)用藥劑質(zhì)量濃度分別為500、1 000、1 500 mg/L對(duì)幼苗中部葉片處理24 h后，上部葉片、莖部和根部均能檢測(cè)到微量的春雷霉素，其中1 500 mg/L處理組在72 h后，春雷霉素在根部的累計(jì)含量可高達(dá)21.03μg/L，表明番茄葉片吸收藥劑后，藥劑能向根部輸導(dǎo)。綜合以上皆說(shuō)明春雷霉素在番茄幼苗體內(nèi)具有雙向輸導(dǎo)特性，即可以向上輸導(dǎo)至頂部葉片，也可以向下運(yùn)輸至根部。

Michelet等[10]證明了植物質(zhì)膜ATPase活性存在一個(gè)最適pH值，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)弱酸性和中性環(huán)境有利于番茄幼苗對(duì)春雷霉素的吸收，在pH為5時(shí)吸收量達(dá)到最大；在pH為9時(shí)吸收量最小。低溫對(duì)春雷霉素的吸收有一定的抑制作用，與前人證明低溫能抑制黃瓜對(duì)硅、小麥對(duì)菲主動(dòng)吸收[11]的結(jié)果一致。4℃條件下的吸收量明顯少于24℃條件下的吸收量，不同時(shí)間段的Q10值均大于2，表明番茄幼苗對(duì)春雷霉素的吸收屬于主動(dòng)吸收過(guò)程。DNP是一種能量抑制劑，CCCP是一種解偶聯(lián)劑[12]，二者可以作為判斷植株對(duì)某種化合物的吸收是否需要能量的標(biāo)志[13-15]。用CCCP、DNP處理后發(fā)現(xiàn)，春雷霉素吸收量受到顯著抑制，高濃度處理組抑制率分別可達(dá)60.12%、60.28%。為進(jìn)一步驗(yàn)證此吸收過(guò)程是否有載體蛋白參與，采用單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白競(jìng)爭(zhēng)性底物D-葡萄糖和根皮苷進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者都對(duì)番茄幼苗吸收春雷霉素產(chǎn)生了抑制作用，與前人證明根皮苷、D-葡萄糖能抑制KPT2細(xì)胞對(duì)慶大霉素的吸收，且慶大霉素在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的吸收是由鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體SGLT2所介導(dǎo)的結(jié)果一致[16-17]，由此表明春雷霉素的吸收可能受單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。

綜上所述，春雷霉素具有較好的內(nèi)吸性，以及具有能同時(shí)向頂和向基運(yùn)輸?shù)奶匦?。其吸收受低溫、能量抑制劑（CCCP、DNP）、pH、單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白競(jìng)爭(zhēng)性底物等因素的影響，說(shuō)明該藥劑的內(nèi)吸傳導(dǎo)是由單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的主動(dòng)吸收的過(guò)程。所得研究結(jié)果有助于雙向輸導(dǎo)型藥劑的開(kāi)發(fā)，以及為指導(dǎo)春雷霉素田間科學(xué)合理用藥提供理論依據(jù)。