張雨薇 何雨軒 丁一 劉程程

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙周病科，成都610041

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，OSCC）約占口腔癌的90%[1]。吸煙、酒精和病毒感染（如人乳頭瘤病毒）是OSCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3]，但仍有15%的病例病因不明[4]。近年來，牙周致病菌被認(rèn)定為OSCC的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周關(guān)鍵致病菌。Katz等[5]研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的檢出量顯著高于正常牙齦組織。P.gingivalis能夠促進(jìn)牙齦上皮細(xì)胞增殖，抑制凋亡，并誘導(dǎo)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。細(xì)胞增殖是細(xì)胞通過分裂，使細(xì)胞數(shù)目增多，并將遺傳信息傳給子代細(xì)胞，細(xì)胞過度增殖則會導(dǎo)致惡性腫瘤。因此，探究P.gingivalis促進(jìn)牙齦上皮細(xì)胞增殖的機(jī)制具有重要意義。

鈣結(jié)合蛋白1（calbindin 1，CALB1）和鈣結(jié)合蛋白2（calbindin 2，CALB2）同是EF-手型家族的鈣結(jié)合蛋白[7]。CALB1在谷氨酸受體激活后可調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，在正常骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元[8-10]以及骨肉瘤細(xì)胞U2OS、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞[11-13]中抑制多種促凋亡信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，常用于測定細(xì)胞凋亡[14]。CALB1能夠調(diào)節(jié)腫瘤抑制蛋白p53。在卵巢癌細(xì)胞中，CALB1可作用MDM2，促進(jìn)p53與MDM2的相互作用，導(dǎo)致p53蛋白降解[12]。p53蛋白水平及其轉(zhuǎn)錄活性受到MDM2調(diào)控，而MDM2的基因表達(dá)受到p53調(diào)控，形成負(fù)反饋通路[15]。目前P.gingivalis對CALB1表達(dá)的影響尚無報(bào)道。CALB2首次在視網(wǎng)膜中被發(fā)現(xiàn)，由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞群、暗斑和水平細(xì)胞表達(dá)[16]。CALB2在皮膚表皮細(xì)胞和皮膚腺上皮表達(dá)，并受到甲狀腺激素紊亂的顯著影響[17]。成人Malassez上皮亞群中也有表達(dá)，是成釉細(xì)胞瘤上皮、子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和間皮細(xì)胞標(biāo)志物[18-21]。本研究用CA9-22細(xì)胞體外模擬牙齦上皮細(xì)胞，探究P.gingivalis感染對CA9-22中CALB1表達(dá)的影響，以及CALB1在P.gingivalis影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡中的作用，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

P.gingivalisATCC 33277、P.gingivalisW83、戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii,S.gordonii）DL1由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。CA9-22細(xì)胞株購買自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基、高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑、Taqman探針（Thermo Fisher Scientific公司，美國），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），CALB1抗體、MDM2抗體、p53抗體、GAPDH抗體（CST公司，美國），Trizol（Invitrogen公司，美國），RNAeasy plus試劑盒（Qiagen公司，德國），LipoJet轉(zhuǎn)染試劑（SignaGen公司，美國），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）細(xì)胞增殖酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Ab‐cam公司，英國），細(xì)胞凋亡熒光底物（EnzChek公司，美國），RIPA緩沖液（Roche公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒、電化學(xué)發(fā)光試劑（Invitro‐gen公司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

1）探究P.gingivalis感染對CA9-22細(xì)胞CAL-B1表達(dá)的影響。①P.gingivalis感染對CA9-22細(xì)胞CALB1、CALB2 mRNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分為未感染組、P.gingivalisATCC 33277感染組、P.gingivalisW83感染組、S.gordoniiDL1感染組，采用qPCR法檢測CALB1、CALB2 mRNA表達(dá)。②P.gingivalis感染對CA9-22細(xì)胞CALB1蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分為對照組和P.gingivalisATCC 33277感染組[包括感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10、50、100三亞組]，采用免疫印跡法檢測CALB1蛋白表達(dá)。③大腸桿菌LPS對CA9-22細(xì)胞CALB1表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)分為未處理組和大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）處理組，采用qPCR法檢測CALB1 mRNA表達(dá)。

2）探究CALB1基因?qū).gingivalisATCC 33277感染時(shí)CA9-22細(xì)胞增殖和凋亡的影響。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為未感染siRNA-Con組（未感染+siRNA沉默空白基因）、P.gingivalis感染siRNA-Con組（P.gingivalis感染+siRNA沉默空白基因）、未感染si-RNA-CALB1組（未感染+siRNA沉默CALB1基因）、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組（P.gingivalis感染+siRNA沉默CALB1基因），采用BrdU進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)分為未感染組、P.gingivalis感染組、P.gingivalis感染siRNA-Con組、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組，采用Cas‐pase-3活性測定法分析細(xì)胞凋亡情況。

3）探究CALB1基因?qū)DM2和p53蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分為未感染siRNA-Con組、P.gingivalis感染siRNA-Con組、未感染siRNA-CALB1組、P.gingivalis感染siRNA-CALB1組，其中P.gingivalis感染組中均為P.gingivalisATCC 33277感染。采用免疫印跡法檢測MDM2、p53蛋白表達(dá)。

1.3 細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)

P.gingivalis培養(yǎng)在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基補(bǔ)充酵母提取物（1 mg·mL-1）、氯高鐵血紅素（5μg·mL-1）和維生素K（1μg·mL-1）中，37℃厭氧培養(yǎng)；S.gordonii培養(yǎng)在腦心浸液培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。

使用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，將CA9-22細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2、37℃恒溫條件下。隔日換液，2～3 d后使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，DMEM終止消化并離心后，重懸接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞傳代。

將細(xì)胞培養(yǎng)至約80%時(shí)，采用MOI 10、50、100的細(xì)菌刺激1 h，然后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)23 h，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[22]。

1.4 qPCR

Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，進(jìn)一步采用RNAeasy plus試劑盒純化RNA。使用高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA（2μg）反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR。將加好樣品的96孔板放在ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。引物序列：CALB1上游5’-ATGGCAGAATCCCACCTGCA-3’，下游5’-CTAGTTATCCCCAGCACAGAG-3’；CALB2上游5’-CCTGCACCTGGCCGAGCTGACG-3’，下游5’-GCTGGAGCCCACGTGCTGCCTG-3’；GAPDH上游5’-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游5’-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3’。設(shè)置PCR循環(huán)條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃15 s，共40個(gè)循環(huán)。自動(dòng)計(jì)算閾值，每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值（Ct）。使用2ΔΔCt法對CALB1和CALB2基因的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

1.5 RNA干擾

細(xì)胞生長到約60%時(shí)，通過Lipojet轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至CA9-22細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)基并加入細(xì)菌刺激24 h。收集細(xì)胞，qPCR檢測目標(biāo)基因敲除情況。

1.6 免疫印跡法

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液冰上充分裂解細(xì)胞，低溫離心后取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。配置12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳轉(zhuǎn)膜后，使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h后，分別加入CALB1、MDM2、p53及GAPDH兔抗人一抗，4℃過夜。TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h再次TBST洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色。

1.7 免疫熒光法

CA9-22細(xì)胞在腔室載玻片上生長至60%時(shí)，采用P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）刺激細(xì)胞24 h，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透后，使用2%BSA封閉45 min，加入CALB1兔抗人一抗孵育1 h，洗滌后將樣本分別與Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗和Texas Red?-X鬼筆環(huán)肽共孵育1 h，最后使用含DAPI染料的中性樹脂封片。通過Leica SP8共聚焦顯微鏡對樣本進(jìn)行掃描，并采集圖像。

1.8 BrdU細(xì)胞增殖分析

在P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）感染結(jié)束前2 h，用10μmol·L-1BrdU標(biāo)記CA9-22細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液清洗2次后用70%乙醇固定細(xì)胞30 min，磷酸鹽緩沖液再次清洗后進(jìn)行染色。用過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育細(xì)胞30 min，磷酸鹽緩沖液清洗后用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物室溫避光孵育30 min。加入終止液，檢測OD450nm。

1.9 Caspase-3活性測定

將1μg·mL-1喜樹堿（camptothecin，CAM）加入CA9-22細(xì)胞培養(yǎng)液中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡4 h。P.gingivalis感染組加入P.gingivalisATCC 33277（MOI=100）培養(yǎng)24 h，收集、裂解細(xì)胞后，通過Enz-Chek Caspase-3分析試劑盒檢測Caspase-3活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism V8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA和Tukey多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 P.gingivalis感染促進(jìn)CA9-22細(xì)胞CALB1的表達(dá)

qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未感染組相比，P.gingivalisATCC 33277感染組和P.gingivalisW83感染組CA9-22細(xì)胞中CALB1表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；S.gordoniiDL1感染組CALB1表達(dá)無明顯變化。與未感染組相比，P.gingivalis感染組和S.gordonii感染組CA9-22細(xì)胞中CALB2表達(dá)均無明顯變化（圖1A）。與未處理組相比，大腸桿菌LPS處理組CA9-22細(xì)胞中CALB1表達(dá)升高（圖1B）。

圖1 qPCR檢測CA9-22細(xì)胞中CALB1和CALB2的表達(dá)Fig 1 Detecting the expression of CALB1 and CALB2 in CA9-22 cells by qPCR

免疫印跡法檢測CA9-22細(xì)胞中CALB1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，P.gingivalisATCC 33277感染組CA9-22細(xì)胞中CALB1表達(dá)升高，各條帶呈MOI依賴性（圖2A、B）。免疫熒光檢測顯示，P.gingivalisATCC 33277感染組中CALB1蛋白熒光較對照組更明顯（圖2C）。

圖2 CA9-22細(xì)胞中CALB1蛋白表達(dá)Fig 2 Expressionsof CALB1 in CA9-22 cells

2.2 CALB1影響P.gingivalis誘導(dǎo)的CA9-22細(xì)胞增殖

BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3A。與未感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-Con組的吸光度值增加；與未感染siRNA-CALB1組相比，P.gin-givalis感染siRNA-Con組的吸光度值無明顯變化?？梢?，P.gingivalisATCC 33277感染促進(jìn)了CA9-22細(xì)胞增殖，而降低CALB1的表達(dá)后可抑制P.gingivalisATCC 33277對CA9-22細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

圖3 CALB1基因?qū).gingivalis感染時(shí)CA9-22細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig 3 The effects of CALB1 on proliferation and apoptosis of CA9-22 infected with P.gingivalis

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3B。與未感染組相比，P.gingivalis感染組，P.gingivalis感染siRNA-Con組和P.gingivalis感染siRNA-CALB1組中CA9-22細(xì)胞Caspase 3活性均明顯降低（P<0.00 1）；與P.gingivalis感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1組CA9-22細(xì)胞Caspase 3活性無明顯變化。可見，下調(diào)CALB1表達(dá)不影響P.gingivalis感染對CA9-22凋亡的抑制作用。

2.3 CALB1通過MDM2-p53途徑調(diào)控細(xì)胞增殖

免疫印跡法和蛋白表達(dá)定量分析檢測結(jié)果見圖4。與未感染組相比，P.gingivalis感染后CA9-22細(xì)胞MDM2表達(dá)升高，p53表達(dá)降低。與P.gingivalis感染siRNA-Con組相比，P.gingivalis感染siRNA-CALB1組CA9-22細(xì)胞MDM2表達(dá)降低，p53表達(dá)升高。

圖4 CALB1對CA9-22細(xì)胞中MDM2和p53表達(dá)的影響Fig 4 Theeffectsof CALB1 on the expression of MDM2 and p53 in CA9-22

3 討論

P.gingivalis是牙周關(guān)鍵致病菌，可內(nèi)化于上皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，引發(fā)細(xì)胞異常遷移，被認(rèn)為是P.gingivalis引起上皮細(xì)胞功能紊亂的重要原因[6]。鈣結(jié)合蛋白是一種對鈣離子有高度親和性的蛋白質(zhì)，通過鈣離子信號傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)[23]。本課題從qPCR、免疫印跡、免疫熒光和RNA干擾等多個(gè)角度進(jìn)行研究，結(jié)果表明P.gingivalis感染可導(dǎo)致CA9-22細(xì)胞CALB1表達(dá)顯著增加，而降低CALB1的表達(dá)，可以顯著抑制P.gingivalis誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與MDM2-p53途徑有關(guān)。

鈣結(jié)合蛋白作為細(xì)胞第二信使系統(tǒng)的重要成分，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)。研究[13]表明，CALB1表達(dá)下調(diào)后，骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖被顯著抑制，細(xì)胞凋亡被促進(jìn)。本研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis感染對CA9-22細(xì)胞中CALB2的表達(dá)無顯著影響，但可導(dǎo)致CALB1表達(dá)顯著上調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。降低CALB1表達(dá)會顯著抑制P.gingivalis誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。這表明CALB1在P.gingivalis促進(jìn)CA9-22細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞凋亡方面，本研究發(fā)現(xiàn)，P.gingivalis可以抑制CAM誘導(dǎo)的CA9-22凋亡，但下調(diào)CALB1表達(dá)對CA9-22細(xì)胞凋亡無顯著影響，這提示P.gingivalis對CA9-22細(xì)胞凋亡的抑制作用不依賴于CALB1。

腫瘤抑制蛋白p53參與細(xì)胞增殖、代謝、衰老和凋亡等過程的大量基因的主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在預(yù)防細(xì)胞惡變中發(fā)揮重要作用。P.gingivalis的LPS可異常調(diào)節(jié)p53，并通過影響其下游炎性基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[24]。P.gingivalis的FimA菌毛蛋白可以降低p53水平，加速原代牙齦上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖[25]。p53的穩(wěn)定性和活性受CHK2、Aurora A、CK1δ、CK1ε等激酶的影響。在P.gingivalis感染的牙齦上皮細(xì)胞中，這些激酶被抑制，進(jìn)而影響P53的活性[26-27]。由此可見，P.gingivalis可以通過調(diào)節(jié)p53促進(jìn)細(xì)胞增殖。MDM2不僅可與p53的反式激活結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制p53[28]，也可以通過E3泛素連接酶的作用，將p53經(jīng)泛素途徑降解[12]。Cao等[12]通過蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中，CALB1可與內(nèi)源性MDM2結(jié)合，促進(jìn)MDM2和p53的相互作用，抑制p53。本研究免疫印跡法結(jié)果顯示，P.gingivalis感染的CA9-22細(xì)胞中MDM2表達(dá)升高而p53表達(dá)降低；當(dāng)降低CALB1表達(dá)后，MDM2表達(dá)降低，而p53表達(dá)升高，表明P.gingivalis感染促進(jìn)CALB1表達(dá)，CALB1可能作為輔助激活因子通過影響MDM2-p53進(jìn)而促進(jìn)CA9-22細(xì)胞增殖。

綜上所述，P.gingivalis可以通過上調(diào)CALB1的表達(dá)誘導(dǎo)CA9-22細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與MDM2-p53通路有關(guān)。本研究結(jié)果為P.gingivalis促進(jìn)上皮功能紊亂機(jī)制的研究提供了新的靶點(diǎn)和思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。