馬玉瑩蘆昕張利娟劉育含李帆譚凱璇張穎李修珍楊芳

1.青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島266071；2.大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連116044；3.臨沂市婦幼保健院口腔科，臨沂276002；4.青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，青島266000；5.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，天津300070

根管治療是牙髓炎和根尖周炎最有效、最常規(guī)的治療方法，而根管治療的成功與否取決于根管內(nèi)的感染物能否徹底清除以及根管內(nèi)感染能否得到控制。其中，糞腸球菌被認(rèn)為是與根管感染相關(guān)的主要病原體[1]，有效抑制糞腸球菌在根管治療的成功中就顯得尤為重要。

盡管根管機(jī)械預(yù)備技術(shù)已相當(dāng)成熟，但仍有至少35%～50%的根管壁難以被器械預(yù)備[2]，無法達(dá)到徹底清除根管系統(tǒng)內(nèi)感染物質(zhì)的目的，還需輔以沖洗液的機(jī)械或化學(xué)作用來達(dá)到。次氯酸鈉是臨床常用根管沖洗液，有良好的組織溶解能力和抗菌能力[3]，其常用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～5.25%。

目前評價藥物對病原微生物作用效果的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過最小抑制濃度（minimum inhibitory con‐centration，MIC）對目標(biāo)藥物進(jìn)行定量評價[4]。傳統(tǒng)藥物評價技術(shù)主要作用于細(xì)胞群體水平，忽略了細(xì)胞異質(zhì)性，而藥物作用下產(chǎn)生的細(xì)胞異質(zhì)性則是致病菌產(chǎn)生耐藥的基礎(chǔ)。病原菌的異質(zhì)性水平必須降低到一定水平才能保證抗菌劑良好的作用效果。最小抑菌濃度的測定僅能考察微生物生長抑制效果，而未考慮細(xì)胞活性，忽略了不生長但具有代謝活性（nongrowing but metabolically active，NGMA）的持留菌群體。細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞代謝活性的存在正是導(dǎo)致耐藥性及疾病復(fù)發(fā)的重要因素[5]。

重水拉曼技術(shù)是一種不依賴細(xì)胞培養(yǎng)的、在單細(xì)胞水平上，快速、定量、無損、高通量的評價抗菌劑對目標(biāo)微生物的代謝抑制效果的技術(shù)手段，并已應(yīng)用于臨床藥物評價篩選、微生物種類鑒別[6]等領(lǐng)域。Tao等[7]采用重水拉曼技術(shù)在單細(xì)胞水平表征不同口腔抑菌劑對變異鏈球菌UA159、血鏈球菌ATCC10556等多種細(xì)菌代謝活性的影響，證實(shí)了拉曼光譜中的重水峰[（C-D峰）2 040～2 300 cm-1區(qū)域]是細(xì)胞生理代謝活性的生物學(xué)指示標(biāo)志，其所占比例可用于分析藥物刺激目標(biāo)菌株后的代謝反應(yīng)；并提出最低抑制代謝濃度（mini‐mum inhibitory concentration based on metabolic ac‐tivity，MIC-MA）[使目標(biāo)菌株在藥物作用8 h后的ΔC-D-ratio（當(dāng)前時間與0 h的C-D ratio（重水峰所占面積）差值）均值≤0且標(biāo)準(zhǔn)差≤0.005的最小藥物濃度]評價抗菌劑對目標(biāo)菌種的代謝抑制作用，為重水拉曼技術(shù)研究抗菌藥物對病原菌的功能抑制作用提供理論和數(shù)據(jù)支持。

隨著各種抗菌劑的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)嚴(yán)重影響到傳統(tǒng)藥物對相關(guān)疾病的治療效果，甚至產(chǎn)生超級病原菌，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。為了減少根管封藥菌株的產(chǎn)生、根管治療失敗及難治性根尖周炎的發(fā)生，降低高濃度用藥導(dǎo)致的毒副作用，指導(dǎo)臨床合理用藥，單細(xì)胞藥物評價系統(tǒng)成為大勢所趨。本實(shí)驗(yàn)采用糞腸球菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究重水對糞腸球菌生長的影響及其對重水的吸收規(guī)律，評價重水拉曼技術(shù)的普適性，并應(yīng)用重水拉曼技術(shù)評價次氯酸鈉對糞腸球菌生長和代謝的抑制效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株糞腸球菌ATCC29212購自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，甘油菌種于-80℃條件下儲藏。

1.2 材料和儀器

5.25%次氯酸鈉（福建維真園醫(yī)藥科技有限公司）；全自動生長曲線分析儀（Lab systems公司，芬蘭）；超凈工作臺（Thermo Scientific公司，美國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（Shelab公司，美國）；96孔板（Corning公司，美國）；酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國）；共聚焦顯微拉曼光譜儀（Horiba公司，法國）；CaF2玻片（Crystran limited公司，英國）；99.99%D2O（Sigma-Aldrich公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 重水標(biāo)記的糞腸球菌生長周期觀察 1）將凍存的糞腸球菌ACTT29212劃線接種于腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基表面，于37℃培養(yǎng)24 h后貯藏在4℃條件下。2）挑取糞腸球菌ATCC29212單克隆菌落接種于5 mL BHI培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用BHI培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5。3）將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10分別接種于含不同重水濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%）的BHI培養(yǎng)液中（0%為對照組），37℃條件下每隔15 min定時測定菌液樣本的OD600值，設(shè)定觀測時間段為0～12 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個時間點(diǎn)設(shè)置3個生物學(xué)平行。

1.3.2 圖譜中重水峰面積與所加重水濃度的關(guān)系研究 糞腸球菌ATCC29212培養(yǎng)同前。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期，OD600=0.5的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10分別接種于含不同重水濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%）的BHI培養(yǎng)液中（0%為對照組），37℃條件下培養(yǎng)12 h，每個重水濃度分別隨機(jī)測定30個單細(xì)胞拉曼圖譜。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

拉曼圖譜采集：使用基于LabRam HR型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡，采用532 nm的Nd:YAG激光源，使用Newton EMCCD采集散射光子，采用每毫米300線規(guī)格的分光光柵，在100倍物鏡視野內(nèi)隨機(jī)采集30個單細(xì)胞拉曼圖譜。

1.3.3 重水拉曼技術(shù)評價藥物抑菌效能的敏感性分析 糞腸球菌ATCC29212培養(yǎng)同前。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期，OD600=0.5的糞腸球菌ATCC29212按照體積比1∶10接種于含30%重水的BHI液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，時間梯度上（0、0.5、1、2、3、4、6、8 h）按照每個時間點(diǎn)進(jìn)行取樣，采集拉曼圖譜及測量OD600值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC測定 糞腸球菌ATCC29212培養(yǎng)同前，將對數(shù)生長期的糞腸球菌ATCC29212菌液調(diào)整濃度至OD600=0.5。于超凈臺內(nèi)打開無菌96孔板，將所獲菌液加入不同濃度（0.2、0.4、0.45、0.6、0.9、1、1.8 g·L-1）次氯酸鈉實(shí)驗(yàn)組及對照組（不含次氯酸鈉）中，每孔內(nèi)液體總體積為200μL，37℃培養(yǎng)24 h，使用酶標(biāo)儀測定0 h和24 h時的OD600值，測定次氯酸鈉作用后的MIC值，ΔOD600≤0.05時對應(yīng)的最低藥物濃度，即次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC[9]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定 糞腸球菌ATCC29212培養(yǎng)同前。將對數(shù)生長期的糞腸球菌ATCC29212菌液調(diào)整濃度至OD600=0.5。將所獲菌液按1∶10比例稀釋至含有0 g·L-1、0.225 g·L-1（0.5×MIC）、0.45 g·L-1（1×MIC）、0.9 g·L-1（2×MIC）濃度次氯酸鈉和30%重水的BHI培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8 h時間梯度取樣。

獲得的樣品經(jīng)200μL超純水洗滌，離心后棄上清，此操作重復(fù)3次。然后使用超純水重懸糞腸球菌細(xì)胞后取2μL稀釋液點(diǎn)在CaF2玻片表面，超凈臺內(nèi)自然風(fēng)干，100倍物鏡下在不同視野內(nèi)隨機(jī)收集測量約30個單細(xì)胞拉曼圖譜。

將采集到的拉曼光譜用LabSpece 5軟件進(jìn)行拉曼圖譜的背景去除、基準(zhǔn)線歸一化和最大值標(biāo)準(zhǔn)化處理后，即可計(jì)算圖譜中重水峰面積。通過計(jì)算8 h和0 h的重水峰所占面積的差值得到ΔC-D ratio，當(dāng)ΔC-D ratio≤0且標(biāo)準(zhǔn)差≤0.005時對應(yīng)的最低藥物濃度即為次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA[7]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

為進(jìn)一步探究糞腸球菌ATCC29212的代謝活性是否會隨培養(yǎng)時間的延長而升高，本研究將糞腸球菌ATCC29212的培養(yǎng)時間延長至24 h，并繪制了平均重水峰所占面積隨時間變化的折線圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中定量數(shù)據(jù)均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用T檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用R（3.6.1版本）軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，由于拉曼圖譜包含多個數(shù)據(jù)點(diǎn)為多維數(shù)據(jù)，因此拉曼圖譜之間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重水標(biāo)記糞腸球菌生長周期的觀察結(jié)果

將糞腸球菌ATCC29212暴露于含不同重水濃度的培養(yǎng)基中分別測定OD600值，與未加重水的對照組相比，培養(yǎng)基中重水濃度≤40%時，糞腸球菌ATCC29212的生長不會受到抑制（P>0.05）；濃度在50%時，糞腸球菌ATCC29212的生長受到一定程度抑制（P=0.028，P<0.05）（圖1）。因此，當(dāng)重水濃度低于40%時，重水的毒性不成為本實(shí)驗(yàn)的限制因素。

圖1 糞腸球菌ATCC29212在不同重水濃度下OD600隨時間的變化Fig 1 The temporal change of OD600 for Enterococcus faecali s ATCC29212 under different D2Olevels

2.2 圖譜中重水峰面積與所加重水濃度之間關(guān)系的研究結(jié)果

除不含重水的對照組外，不同濃度重水培養(yǎng)的糞腸球菌ATCC29212的拉曼圖譜在2 040～2 300 cm-1區(qū)域均會出現(xiàn)重水峰（圖2），且重水峰大小隨重水濃度的增加而增加，重水峰所占面積與所加入重水濃度呈線性正相關(guān)關(guān)系（R2=0.958 5，P<0.001）（圖3）。該結(jié)果表明：糞腸球菌ATCC-29212能夠活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測出來，因此本研究選擇既不影響糞腸球菌ATCC-29212生長狀態(tài)，又能顯示出明顯重水峰的重水濃度——30%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重水濃度。

圖2 糞腸球菌ATCC29212的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 2 The single cell Raman spectrum of Enterococcus faecali s ATCC29212

圖3 穩(wěn)定期糞腸球菌ATCC29212單細(xì)胞拉曼圖譜中重水峰所占面積與重水濃度之間關(guān)系Fig 3 Therelationshipbetween C-Dratioand D2Oconcentrationin SCRSof Enterococcusfaecali sATCC29212atstablephase

2.3 重水拉曼技術(shù)評價藥物抑菌效能的敏感性分析結(jié)果

隨著糞腸球菌ATCC29212在含有30%重水培養(yǎng)基中培養(yǎng)時間的延長，重水峰的強(qiáng)度如圖4所示，單細(xì)胞拉曼圖譜中重水峰所占面積與OD600隨時間變化趨勢如圖5所示?；诖x活性的重水峰幾乎在加入30%重水后的即刻就出現(xiàn)，并在30 min時即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而基于生長的吸光度值OD600的明顯變化在3 h后才出現(xiàn)。因此基于代謝活性的技術(shù)手段較為敏感。

圖4 糞腸球菌ATCC29212在30%重水濃度下隨時間變化的單細(xì)胞拉曼圖譜Fig 4 The temporal change of SCRS for Enterococcus faecali s ATCC29212 under 30%D2O

2.4 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC測定結(jié)果

次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC測定結(jié)果顯示：在次氯酸鈉濃度分別為0.2、0.4 g·L-1時，ΔOD600>0.05；在次氯酸鈉濃度為0.45、0.6、0.9、1、1.4、1.8 g·L-1時，ΔOD600<0.05。因此，次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC為0.45 g·L-1。

2.5 次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定結(jié)果

次氯酸鈉對糞腸球菌的MIC-MA測定結(jié)果表明：次氯酸鈉濃度在0.225 g·L-1（0.5×MIC）及0.45 g·L-1（1×MIC）時，ΔC-D-ratio>0；次氯酸鈉濃度在0.9 g·L-1（2×MIC）時，ΔC-D-ratio<0且標(biāo)準(zhǔn)差<0.005，ΔC-D ratio值明顯降低（P<0.001）。因此，糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA為0.9 g·L-1，即2×MIC。

隨著次氯酸鈉藥物濃度的升高，ΔC-D-ratio呈下降趨勢，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)藥物濃度達(dá)到MIC-MA時，絕大多數(shù)糞腸球菌ATCC29212進(jìn)入小于0的“代謝靜止區(qū)”，而在MIC濃度下，大部分細(xì)菌細(xì)胞沒有進(jìn)入“代謝靜止區(qū)”，仍存在代謝活性（圖6）。

圖6 次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的MIC-MA測定Fig 6 The measurement of MIC-MA of NaClO for Enterococcus faecali s ATCC29212

拉曼圖譜中重水峰所占面積的時間動態(tài)變化曲線顯示（圖7），次氯酸鈉濃度為MIC時，雖然重水峰的增長低于未加藥的對照組，且保持在一個較低的水平，但8 h時的重水峰較0 h時高，將糞腸球菌ATCC29212的培養(yǎng)時間延長至24 h后，結(jié)果顯示（圖8），MIC濃度次氯酸鈉刺激下的糞腸球菌ATCC29212的重水峰所占面積大幅回升，達(dá)到對照組的93%；而藥物濃度在MIC-MA時，糞腸球菌ATCC29212的代謝活性在24 h內(nèi)始終保持在基線水平。

圖7 8 h內(nèi)糞腸球菌ATCC29212在不同濃度次氯酸鈉作用下重水峰所占面積的時間梯度曲線Fig 7 Temporal dynamics of C-D ratio of Enterococcus faecali s ATCC29212 under different concentrations of NaClO in 8 h

圖8 24 h內(nèi)糞腸球菌ATCC29212在不同濃度次氯酸鈉作用下重水峰所占面積的時間梯度曲線Fig 8 Temporal dynamics of C-D ratio of Enterococcus faecali s ATCC29212 under different concentrations of NaClO in 24 h

3 討論

本研究測定了次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC-29212生長及代謝的影響，建立了抗菌劑對細(xì)菌代謝活性的作用模型，評價了重水拉曼技術(shù)的先進(jìn)性、優(yōu)越性及可靠性，為后期評價抗菌劑對細(xì)菌作用效能等方面的研究提供了新思路及理論依據(jù)。

傳統(tǒng)藥物評價系統(tǒng)多是依賴細(xì)胞生長的、微生物群體水平上的檢測手段，不僅耗時長、對難以培養(yǎng)的細(xì)菌束手無策、忽略了細(xì)胞間的異質(zhì)性是產(chǎn)生耐藥性的基礎(chǔ)，而且無法研究微生物群體中小部分NGMA狀態(tài)的持留菌細(xì)胞。持留菌是細(xì)菌中普遍存在的，處于休眠狀態(tài)的一類特殊小亞群。它們通過降低代謝活性和生長速率，進(jìn)入代謝性休眠的非分裂狀態(tài)來抵抗致死濃度抗菌劑的威脅，維持自身的生存，其代謝活動隨著外界環(huán)境的變化而變化[10]。持留菌對逆境的不應(yīng)答性和代謝活動的變化使其能夠耐受不利環(huán)境而存活，這種細(xì)菌的持留性在感染的復(fù)發(fā)及慢性感染中扮演著重要角色[11-12]，而且與細(xì)菌耐藥性的增加有關(guān)[5,13]，它們的存在增加了細(xì)菌感染治療的難度。若糞腸球菌以低代謝活性的狀態(tài)在根管中長時間存留，則可能導(dǎo)致根管治療失敗及難治性根尖周炎的發(fā)生[14-16]。因此，停留在抑制細(xì)菌生長層面的研究已無法滿足現(xiàn)代化臨床治療的需要。

隨著細(xì)菌耐藥問題的日益嚴(yán)峻，人們急需新型抗菌劑及新的藥物評價手段來幫助臨床合理用藥。目前，單細(xì)胞技術(shù)評價細(xì)菌對藥物刺激的反應(yīng)主要是通過熒光標(biāo)記法，通過研究某個基因以及下游表達(dá)產(chǎn)物在藥物刺激下的表型來評價藥物作用效果。而熒光標(biāo)記技術(shù)需要外源性標(biāo)記物，會干擾細(xì)胞正常生理功能。單細(xì)胞拉曼技術(shù)雖無需外源性標(biāo)記且能夠反映細(xì)胞分子生物學(xué)構(gòu)成，但拉曼光譜也存在著對細(xì)胞基因?qū)W背景、生理學(xué)狀態(tài)及環(huán)境因素等極度敏感等缺陷。因此，本課題組發(fā)展了一種重水同位素標(biāo)記技術(shù)與單細(xì)胞拉曼技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)手段，基于抗菌劑作用下細(xì)菌對重水的代謝差異，在單細(xì)胞水平上揭示細(xì)菌代謝活性的信息，實(shí)現(xiàn)對抗菌劑作用效能的快速判定，評價藥物作用效果。

重水中的D+能夠被有代謝活性的微生物細(xì)胞通過置換NADPH中的H+來合成細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，從而在拉曼圖譜中2 040～2 300 cm-1的區(qū)域出現(xiàn)重水峰，通過分析重水峰所占面積即可表征藥物作用后細(xì)菌單細(xì)胞水平上的代謝活性，評價藥物抑菌效能[6-7]。不僅如此，單細(xì)胞拉曼技術(shù)還具有非常廣泛的應(yīng)用前景，拉曼圖譜理論上可以涵蓋細(xì)胞內(nèi)全部物質(zhì)的圖譜，尤其是600～1 800 cm-1的“指紋區(qū)”涵蓋著豐富的生物信息，根據(jù)不同峰的變化可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞類型的快速區(qū)分或細(xì)胞對不同刺激反應(yīng)的區(qū)別和分類[17]。

重水拉曼技術(shù)作為一種評價抗菌劑對目標(biāo)微生物的代謝抑制效果的技術(shù)手段，采用重水作為標(biāo)記物，其特點(diǎn)為不依賴細(xì)菌生長、快速、定量、無損、高通量。細(xì)菌在含重水的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0.5 h即可測得明顯重水峰，8 h內(nèi)即可快速鑒定篩選對目標(biāo)菌株有效的抗菌劑。與傳統(tǒng)依賴細(xì)胞生長的藥物評價方法相比，可更快更準(zhǔn)確地評估藥物作用后細(xì)菌細(xì)胞的代謝水平，降低疾病的復(fù)發(fā)率[7,18]，為持留菌的臨床防治提供新思路。

本研究探究了糞腸球菌ATCC29212在不同濃度重水中的生長狀態(tài)及對重水的吸收規(guī)律，結(jié)果顯示，8 h內(nèi)培養(yǎng)基中重水濃度為30%時，糞腸球菌ATCC29212的生長狀態(tài)不會受到抑制（P>0.05），細(xì)胞可穩(wěn)定代謝重水，在拉曼圖譜2 040～2 300 cm-1區(qū)域出現(xiàn)明顯重水峰，且重水峰的時間變化趨勢易被檢測到，因此選取30%濃度重水用于重水拉曼技術(shù)定量檢測抗菌劑對糞腸球菌ATCC-29212抑菌效能的研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)評價了次氯酸鈉對糞腸球菌ATCC29212的抑菌效能，通過肉湯稀釋法測定了其MIC，基于重水拉曼技術(shù)測定其MICMA，結(jié)果顯示，MIC-MA值為MIC值的2倍。往期研究也得到了類似結(jié)果，Tao等[7]在探究口腔抑菌藥物對變異鏈球菌抑菌效果時發(fā)現(xiàn)，氟化鈉與氯己定對變異鏈球菌的MIC-MA值均高于MIC值，分別為3×MIC和2×MIC。證明藥物在傳統(tǒng)MIC濃度時雖抑制了細(xì)胞生長，但仍不能完全抑制目標(biāo)細(xì)菌的代謝活性，24 h時該菌代謝活性的大幅回升也證明了這一點(diǎn)，細(xì)胞仍可進(jìn)行代謝活動從而對人體產(chǎn)生危害；而在MIC-MA濃度下，細(xì)菌細(xì)胞的生長與代謝在一定時間內(nèi)均被完全抑制。這充分顯示了重水拉曼技術(shù)對于研究不生長但有代謝活性細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)，即使是較高的MIC-MA濃度也遠(yuǎn)低于次氯酸鈉的臨床常用濃度，但這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是在細(xì)菌純培養(yǎng)條件下獲得的，而牙髓感染通常是多種細(xì)菌導(dǎo)致的混合感染[19]。細(xì)菌在根管系統(tǒng)中主要以生物膜的形式存在，由于生物膜獨(dú)特的三維立體結(jié)構(gòu)和其中因受到營養(yǎng)物質(zhì)限制而處于緩慢生長或不生長狀態(tài)的細(xì)胞等因素[20]，導(dǎo)致以生物膜形式存在的細(xì)菌較浮游菌的耐藥性強(qiáng)100～1 000倍[21]。本實(shí)驗(yàn)僅以次氯酸鈉對浮游狀態(tài)的糞腸球菌ATCC29212的抑菌效能為例，通過單細(xì)胞拉曼光譜實(shí)時探討了藥物的抗菌特性，建立了重水拉曼技術(shù)對抗菌劑作用效果評估的模式體系。后續(xù)重水拉曼技術(shù)憑借其快速、準(zhǔn)確的突出優(yōu)點(diǎn)，可作為一種普適性的、無損且定量的抗菌劑評價手段，進(jìn)一步研究多菌種生物膜狀態(tài)下菌群對抗菌劑的反應(yīng)，以更好地指導(dǎo)臨床合理用藥，避免高濃度用藥及藥物濫用對人體的不良反應(yīng)、減少耐藥菌株的產(chǎn)生，為精準(zhǔn)醫(yī)療奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。