金爽，白雪，許雯惠，陳威沛，呂晨，程玉鵬，崔喆，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

槐角(Fructus Sophorae)為豆科植物槐的果實(shí)，作為一味常用的中藥，可止血涼血、清熱瀉火，性苦、寒，歸肝，大腸經(jīng)。槐角中富含黃酮類和異黃酮類化合物，如染料木素、染料木苷、槐角苷、槐角雙苷等[1-3]。其中，染料木素等異黃酮類化合物是槐角中最主要的成分和標(biāo)志性活性物質(zhì)[4-6]。眾所周知，染料木素具有雌性激素及抗雌性激素性質(zhì)，可以抑制拓?fù)洚愇锩涪虻幕钚院屠野彼岬鞍准っ窹TK的活性，因其抑菌、降血脂、抗氧化等作用已成為國際上的研究和開發(fā)熱點(diǎn)。微生物轉(zhuǎn)化具有較高的立體選擇性、基團(tuán)選擇性和區(qū)域選擇性。與化學(xué)反應(yīng)相比，具有反應(yīng)條件溫和、后處理簡單、污染小、成本低等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵炮制的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究得以大力發(fā)展，但傳統(tǒng)的微生物轉(zhuǎn)化炮制主要以真菌為主，其效果雖好，安全性有待考量。益生菌作為研究熱點(diǎn)一直備受關(guān)注，應(yīng)用益生菌對中藥材進(jìn)行發(fā)酵炮制也逐步成為研究的熱點(diǎn)[7-9]。乳酸菌作為代表性的益生菌以其無毒并具有獨(dú)特的生理功效受到了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，通過乳酸菌發(fā)酵中藥擁有廣闊的發(fā)展前景[10]。

本文對槐角提取物中染料木素的含量進(jìn)行了測定，以乳酸菌發(fā)酵炮制槐角后染料木素的含量為衡量指標(biāo)，通過對pH、溫度和料液比等影響因素進(jìn)行了單因素考察試驗(yàn)，并結(jié)合中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和固載微生物技術(shù)，采用固載乳酸菌發(fā)酵處理中藥槐角，對槐角的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行初步研究，優(yōu)化出最佳的發(fā)酵條件，并對槐角乳酸菌轉(zhuǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)染料木素過程進(jìn)行研究，同時(shí)考察發(fā)酵過程中總黃酮的含量變化，為乳酸菌發(fā)酵炮制中草藥領(lǐng)域的進(jìn)一步深入研究探索及相關(guān)開發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料

槐角購自黑龍江省哈爾濱市藥材市場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蘇連杰教授鑒定為藥典收載品種；乳酸乳球菌購自黑龍江省微生物研究所；HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BPH-9162精密恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；其他試劑均為市售分析純。

2 方法

2.1 固載乳酸乳球菌菌液的制備

向培養(yǎng)好的乳酸乳球菌培養(yǎng)皿中加入20 mL滅菌后的蒸餾水，將菌種用接種環(huán)輕輕刮下，混合均勻備用。

2.2 固載乳酸乳球菌菌球制備

室溫下，取3 mL均勻乳酸乳球菌菌液加入到6 mL濃度為5%的海藻酸鈉溶液中，用注射器量取混合液滴入到3%氯化鈣溶液中，迅速攪拌，制成直徑約為5 mm的菌球，形成形狀完好的菌球后靜置2 h，用無菌水沖洗3次得到固載菌球。

2.3 發(fā)酵基質(zhì)的制備

將槐角研粉碎后過80目篩，稱取1 g槐角粉末投到含有50 mL無糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，121 ℃條件下高壓滅菌30 min，制備得到發(fā)酵基質(zhì)，備用。

2.4 固載乳酸菌發(fā)酵過程

將制備得到的固載乳酸乳球菌球投入到發(fā)酵基質(zhì)后，在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)。

2.5 發(fā)酵中藥槐角后染料木素的提取

將培養(yǎng)后的槐角和固載乳酸乳球菌用濾紙過濾，使發(fā)酵液與槐角和固載乳酸乳球菌分離。將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸干，加入適量80%乙醇，超聲后得到溶解液。然后，再向過濾分離得到的槐角和固載球菌中加入適量80%乙醇溶液，超聲提取30 min，濾紙過濾，重復(fù)提取2次，合并提取液，且將上述溶解液和提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入80%乙醇定容至50 mL，于12 000 r/min離心以備用。

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取蘆丁對照品，加入乙醇，置于水浴溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(蘆丁含量為0.2 mg/mL)。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入30%乙醇至2 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL放置8 min，加入10 %硝酸鋁溶液0.5 mL放置8 min，分別加入4 %氫氧化鈉溶液4.0 mL，定容后搖勻，放置15 min。以0 mL的容量瓶內(nèi)試劑為空白，在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

2.5.2 樣品溶液的制備

取實(shí)驗(yàn)樣品，揮干溶劑，量取3 mL無水乙醇于10 mL容量瓶，加蒸餾水定容后，用等體積石油醚依次萃取，脫脂、脫色素，取水層用于總黃酮的含量測定。

2.6 發(fā)酵中藥槐角后染料木素的檢測

測定在不同pH值(4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)、不同時(shí)間(12、24、36、48、60 h)、以及不同液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)下中藥槐角炮制后發(fā)酵體系中染料木素的含量，確定槐角的最佳發(fā)酵條件。

2.7 中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化發(fā)酵體系條件

根據(jù)2.6發(fā)酵中藥槐角后染料木素的檢測中單因素優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，選擇對該體系中有顯著作用的3個(gè)因素，采用中心組合法進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，并結(jié)合響應(yīng)面法對試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，研究這3個(gè)因素不同水平下的組合對炮制槐角發(fā)酵體系中染料木素含量的影響。

3 結(jié)果

3.1 固載乳酸菌發(fā)酵炮制槐角色譜相圖

槐角原藥材中染料木素含量為(6.53±0.06)mg/g，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化為(18.93±0.47)mg/g，可達(dá)原藥材的2.90倍，見圖1。

注：A.中藥槐角原藥材；B.中藥槐角經(jīng)固載乳酸菌炮制后。

3.2 固載乳酸菌發(fā)酵總黃酮的變化分析

據(jù)分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.221 4x-0.019 2(R=0.998)，總黃酮含量原藥材為(74.00±0.42)mg/g，發(fā)酵36 h時(shí)總黃酮含量可達(dá)(122.00±0.56)mg/g，見表1。

表1 乳酸菌發(fā)酵槐角前后總黃酮含量變化

3.3 固載乳酸菌發(fā)酵體系單因素優(yōu)化

本試驗(yàn)對固載乳酸菌槐角發(fā)酵體系的條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化，考察了pH值、時(shí)間、液料比3個(gè)因素，試驗(yàn)結(jié)果見表2～4。

表2 不同pH發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

由表2可得，pH值對發(fā)酵過程有較大的影響，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)的pH值為5.0時(shí)，槐角體系中的染料木素含量達(dá)到最大值6.24 mg/g。pH 在4.0～5.0時(shí)，槐角體系中染料木素的含量逐漸增加，而pH在5.5～7.0時(shí)，染料木素的含量開始下降。pH作為微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標(biāo)，對菌體的生長和產(chǎn)品的積累有很大的影響，上述發(fā)生的變化取決于菌種的特性和產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)，而pH值的變化會影響酶活力的改變，以致影響產(chǎn)物的合成，但pH值過高會使酶失活而無法發(fā)揮其活性，從而導(dǎo)致生成產(chǎn)物的含量降低。

將該體系放置在pH值為5.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測定不同的發(fā)酵時(shí)間染料木素的含量。由表3可知，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)，槐角體系中的染料木素含量達(dá)到最大值11.73 mg/g。時(shí)間在12.0～36.0 h范圍內(nèi)，槐角體系中染料木素的含量逐漸增加，而在48～72 h時(shí)，染料木素的含量逐漸降低。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中存在最適發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵時(shí)間過短發(fā)酵不完全，過長則損失更多的營養(yǎng)，導(dǎo)致降剩下的量顯著降低，從而影響染料木素的含量。

表3 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

將納豆菌發(fā)酵槐角體系放到按照不同的液料比配制好的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由表4可知，液料比對發(fā)酵過程影響頗大，當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)的液料比為25 mL/g時(shí)，槐角體系中的染料木素含量達(dá)到最大值為18.93 mg/g。液料比在15.0∶1～5.0∶1 mL/g范圍內(nèi)，染料木素的含量逐漸增加，而在25∶1～35∶1 mL/g時(shí)，染料木素的含量逐步下降。分析出現(xiàn)上述的原因是合適的培養(yǎng)基給細(xì)胞提供了充足的氧氣，而培養(yǎng)基的配比過量會影響酶的活性，使其活性降低。

表4 不同液料比發(fā)酵槐角前后染料木素含量變化

3.4 中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化固載乳酸菌發(fā)酵槐角條件

按照單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH(A)、液料比(B)和發(fā)酵時(shí)間(C)作為中心組合設(shè)計(jì)的三個(gè)優(yōu)化因素，具體見表5、表6和表7。

表5 中心組合試驗(yàn)因素與水平表

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表7 二次中心組合設(shè)計(jì)方差分析表

選擇中心組合法對固載乳酸菌發(fā)酵槐角的條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，繼而應(yīng)用相關(guān)的軟件對結(jié)果進(jìn)行回歸分析和方差分析(表 5、6)，用槐角體系中染料木素的含量作響應(yīng)值(Y)，自變量為pH值、發(fā)酵時(shí)間、液料比的二次多元回歸方程：Y=18.82-0.022A+0.68B+1.02C-0.030A×B-0.012A×C+0.24B×C-0.75A2-1.40B2-0.78C2

據(jù)表7可得，P<0.000 1，說明差異極顯著；而模型失擬項(xiàng)是表示模型中的理論值與實(shí)際值不相擬合的概率，本部分中的失擬P=0.0515>0.05，說明模型的失擬度不顯著。

如圖2(a～c)，隨意兩個(gè)交互因素的響應(yīng)面都有最高值。據(jù)分析，發(fā)酵時(shí)間和料液比對發(fā)酵槐角的影響較大，而pH值的影響相對較小。通過軟件分析，最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時(shí)間為36 h、pH 5.0、料液比為25∶1(mL/g)，在此條件下發(fā)酵槐角得到的染料木素含量為(18.93±0.47)mg/g，是原藥材的2.90倍，而最優(yōu)條件下的總黃酮含量為(122.00±0.56)mg/g。

注：a.pH和液料比響應(yīng)面圖；b.pH和發(fā)酵時(shí)間響應(yīng)圖；c.液料比和發(fā)酵時(shí)間響應(yīng)圖。

4 討論

本研究以槐角中總黃酮含量和染料木素含量為指標(biāo)，對固載乳酸菌炮制槐角發(fā)酵體系進(jìn)行了研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法，對固載乳酸菌發(fā)酵槐角的條件進(jìn)一步優(yōu)化，得到槐角最佳的發(fā)酵條件為pH 5.0，液料比25∶1(mL/g)，發(fā)酵時(shí)間36 h，發(fā)酵后得到最優(yōu)染料木素含量為(18.93±0.47)mg/g，是原藥材的2.90倍，而最優(yōu)條件下總黃酮為(122.00±0.56)mg/g，遠(yuǎn)高于未處理時(shí)槐角原藥材的含量。

該研究將益生菌微生物轉(zhuǎn)化與固載技術(shù)結(jié)合發(fā)酵炮制中藥槐角，消除了傳統(tǒng)炮制方法的弊端，研究結(jié)果為槐角的進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，為創(chuàng)新技術(shù)的發(fā)展提供了依據(jù)。