祝智威, 付中民, 隆 琦, 杜 宇, 張文德, 胡 穎,趙 蕭, 史小玉, 徐細(xì)建, 陳大福,2,*, 郭 睿,2,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002;3.江西省養(yǎng)蜂研究所, 南昌 330000)

意大利蜜蜂Apismelliferaligustica是我國(guó)養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的主要蜂種，其工蜂在12 d的封蓋子蛹期歷經(jīng)組織重構(gòu)、器官發(fā)育及體色和眼色加深等關(guān)鍵的變態(tài)發(fā)育過(guò)程(Soaresetal., 2007)。研究表明溫度等外界因素可顯著影響封蓋子的正常發(fā)育、成活率、羽化后的短期記憶行為及社會(huì)性行為(Tautzetal., 2003; Jonesetal., 2005; 姚丹等, 2020)。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、新陳代謝、組織發(fā)育、器官形成和免疫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程(Bartel, 2004; He and Hannon, 2004; Friedmanetal., 2009)。2006年完成西方蜜蜂Apismellifera的基因組測(cè)序并公布(Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006)，隨后miRNA逐漸成為蜜蜂分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一(Liuetal., 2012; Ashbyetal., 2016; Zhuetal., 2017)。此前，ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在蜜蜂中的研究已見諸報(bào)道(Herranzetal., 2012; Liuetal., 2012; Lozanoetal., 2015; Shietal., 2015; Ashbyetal., 2016; Macedoetal., 2016)，但總體仍比較有限。Liu等(2012)曾對(duì)西方蜜蜂哺育蜂和采集蜂頭部的miRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ame-miR-13b在采集蜂中上調(diào)表達(dá)，推測(cè)ame-miR-13b可能參與調(diào)控西方蜜蜂的職能轉(zhuǎn)變。Macedo等(2016)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于有活性的意大利蜜蜂工蜂卵巢和交配后的蜂王卵巢，ame-miR-13b在無(wú)活性的西方蜜蜂工蜂卵巢和處女王中表達(dá)水平更高，作者推測(cè)ame-miR-13b與西方蜜蜂的級(jí)型分化有關(guān)。ame-miR-100被證實(shí)與蛻皮激素(ecdysteroid, Ec)和保幼激素(juvenile hormone, JH)的效應(yīng)具有相關(guān)性，可參與調(diào)節(jié)蜜蜂的級(jí)型分化和蜂王的繁殖過(guò)程(Herranzetal., 2012; Ashbyetal., 2016; Macedoetal., 2016)。Ashby等(2016)研究發(fā)現(xiàn)miR-bantam可參與蜜蜂的細(xì)胞增殖與分化以及組織結(jié)構(gòu)重塑等過(guò)程。此外，miR-13b, miR-100和miR-bantam能夠影響德國(guó)小蠊Blattellagermanica和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的變態(tài)發(fā)育(Bashirullahetal., 2003; Lozanoetal., 2015)以及果蠅的翅發(fā)育(Becametal., 2011)。蜜蜂是一種完全變態(tài)昆蟲，一生歷經(jīng)幼蟲、蛹和成蟲3個(gè)發(fā)育階段，其中蛹期內(nèi)部組織和器官發(fā)生劇烈地消解和重組(梁勤和陳大福, 2009)。然而，蜜蜂蛹期發(fā)育相關(guān)的miRNA研究缺失，ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在蜜蜂蛹期發(fā)育中的調(diào)控作用迄今未明。

本研究利用分子生物學(xué)手段對(duì)ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂蛹期不同日齡封蓋子中的真實(shí)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，并檢測(cè)三者在工蜂蛹期發(fā)育過(guò)程的表達(dá)譜，然后通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)上述3個(gè)miRNA的靶mRNA并分析miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為探明意大利蜜蜂工蜂蛹期發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料

意大利蜜蜂封蓋子取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)教學(xué)蜂場(chǎng)蜂群。選取群勢(shì)較強(qiáng)的3群意大利蜜蜂，將蜂王限制放在空脾上產(chǎn)卵8 h，隨后將蜂王取出，不讓蜂王再次進(jìn)入該巢脾產(chǎn)卵。待蜂子發(fā)育至封蓋后第3天(白眼蛹)，將巢脾提取至實(shí)驗(yàn)室，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)(35±0.5℃，RH 70%)。用鑷子小心將蛹取出，并立即投入液氮速凍，每3頭放入1個(gè)RNA-Free的EP管，隨后放入-80℃進(jìn)行保存。白眼蛹記為P1，此后每24 h連續(xù)取樣至羽化前1 d，P2, P3, P4, P5, P6, P7和P8分別代表每24 h取得的樣品。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 miRNA的stem-loop RT-PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證

參照前期已建立的方法(Chenetal., 2005; 杜宇等, 2019)，通過(guò)stem-loop RT-PCR驗(yàn)證ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam以及內(nèi)參基因actin-1在意大利蜜蜂工蜂蛹期的表達(dá)情況。利用Primer Premier 6軟件分別設(shè)計(jì)miRNA的stem-loop引物、特異性上游引物和通用下游引物以及actin-1基因的上下游引物(表1)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。利用RNA抽提試劑盒(Axygen公司，美國(guó))提取意大利蜜蜂工蜂蛹期(P1-P8)的總RNA，利用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by Stem-loop)(諾唯贊，南京)和stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，用于3種miRNA的PCR反應(yīng)，以無(wú)菌水為模板作為陰性對(duì)照，RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL): PCR Mix 10 μL, DEPC水 7 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共33個(gè)循環(huán)；最后72℃5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的片段(大小約為70 bp)切膠回收，利用零背景TOPO-TA克隆試劑盒(YEASEN，上海)按照說(shuō)明書連接pESI-T載體；然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(唯地，上海)，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。4 000 r/min離心1 min后棄上清，保留80 μL上清重懸沉淀，均勻涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)8 h，挑斑搖菌后進(jìn)行菌液PCR，將陽(yáng)性結(jié)果對(duì)應(yīng)的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司單端測(cè)序。

1.3 miRNA的靶mRNA的預(yù)測(cè)與分析

參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期建立的技術(shù)流程(熊翠玲等, 2018b; 郭睿等, 2019)，聯(lián)用RNAhybrid, miRanda和TargetScan軟件預(yù)測(cè)ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam的靶mRNA，采用軟件默認(rèn)參數(shù)。然后取3種軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為可靠的靶mRNA集合。進(jìn)而采用BLAST軟件將上述靶mRNA比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥geneontology.org/)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.kegg.jp/)，從而得到相應(yīng)的功能和通路注釋。

1.4 miRNA和靶mRNA的RT-qPCR檢測(cè)

利用RNA抽提試劑盒(Promega公司，美國(guó))分別提取意大利蜜蜂工蜂蛹期(P1-P8)不同日齡封蓋子的總RNA，利用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by Stem-loop)(諾唯贊，南京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA模板，用于3種miRNA及內(nèi)參actin-1的RT-qPCR；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(YEASEN，上海)反轉(zhuǎn)錄合成P1-P8的cDNA模板，用于靶mRNA及內(nèi)參actin-2的RT-qPCR檢測(cè)。采用Ct值比較法進(jìn)行基因相對(duì)定量，利用ABI QuantStudio 3熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI 公司，美國(guó))對(duì)miRNA和1.3節(jié)預(yù)測(cè)的靶mRNA XM_016916453.1進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green Dye 10 μL, 1.2節(jié)設(shè)計(jì)的上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板 1 μL, DEPC水補(bǔ)至20 μL。miRNA的反應(yīng)條件: 95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。mRNA的反應(yīng)條件: 95℃ 5 min; 95℃變性15 s, 56℃ 30 s, 72℃ 20 s, 共40個(gè)循環(huán)，熔解曲線程序均默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)置。將上述3個(gè)miRNA及靶mRNA XM_016916453.1在P1時(shí)期的表達(dá)量作為對(duì)照組，在其他日齡的miRNA及靶mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次平行重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.5 miRNA及靶mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

參照范小雪等(2021)的方法，從1.3節(jié)中的靶向預(yù)測(cè)結(jié)果中進(jìn)一步篩選得到結(jié)合自由能小于-20 kcal/mol的靶向結(jié)合關(guān)系，并據(jù)此構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，然后利用Cytoscape軟件實(shí)現(xiàn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)GraphPad Prism 8軟件繪制miRNA和靶mRNA表達(dá)趨勢(shì)的線形圖。采用SPSS軟件對(duì)3個(gè)miRNA在P1-P8蛹期期間的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為顯著性閾值，利用Tukey氏檢驗(yàn)法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 意大利蜜蜂工蜂蛹期的體色和眼色變化

意大利蜜蜂工蜂蛹期的體色和眼色逐漸發(fā)生變化：P1眼色與體色均為白色；P2眼色為粉紅色，體色為白色；P3眼色明顯加深變?yōu)榧t色，體色變?yōu)榈S色；P4眼色繼續(xù)加深變?yōu)樯罴t色，體色變?yōu)辄S色；P5-P8眼色進(jìn)一步加深至黑色，體色趨于深褐色。

2.2 ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期的表達(dá)和序列驗(yàn)證

RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在P1-P8中均能擴(kuò)增出符合預(yù)期大小(約70 bp)的目的片段，證實(shí)了ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期的真實(shí)表達(dá)(圖2: A-C)。進(jìn)一步的Sanger測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與相應(yīng)的測(cè)序序列一致(圖2: E-G)，表明上述3個(gè)miRNA真實(shí)存在。

圖2 意大利蜜蜂工蜂蛹期3種miRNA的stem-loop RT-PCR及Sanger測(cè)序驗(yàn)證

2.3 3個(gè)miRNA的靶mRNA預(yù)測(cè)及其功能注釋

靶向預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam分別靶向結(jié)合850, 136和506條靶mRNA。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，上述3個(gè)miRNA的靶mRNA均涉及生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類的多個(gè)條目，其中ame-miR-13b靶向的mRNA可注釋到32個(gè)條目，在生物學(xué)進(jìn)程大類注釋靶mRNA數(shù)量最多的條目是細(xì)胞進(jìn)程(281條)、單一組織進(jìn)程(229條)、代謝進(jìn)程(180條)、應(yīng)激反應(yīng)(86條)和生物學(xué)調(diào)控(82條)；在細(xì)胞組分大類注釋靶mRNA數(shù)量最多的條目是細(xì)胞(110條)，細(xì)胞部分(110條)，細(xì)胞膜(107條)，細(xì)胞膜部分(107條)，細(xì)胞器(98條)；在分子功能大類注釋靶mRNA數(shù)量最多的條目是結(jié)合(294條)，催化活性(153條)，分子傳感器活性(54條)，信號(hào)傳感器活性(47條)和轉(zhuǎn)運(yùn)子活性(45條)(圖3: A)。ame-miR-100靶向的mRNA可注釋到24個(gè)條目，在生物學(xué)進(jìn)程大類中富集靶mRNA數(shù)量最多條目的是細(xì)胞進(jìn)程(36條)，代謝進(jìn)程(30條)，單一組織進(jìn)程(27條)，多細(xì)胞生物進(jìn)程(16條)，信號(hào)(7條)；在細(xì)胞組分大類中富集靶mRNA數(shù)量最多的條目是細(xì)胞(28條)，細(xì)胞部分(28條)，細(xì)胞器(21條)，細(xì)胞膜(5條)，細(xì)胞膜部分(5條)；在分子功能大類中富集靶mRNA數(shù)量最多的條目是結(jié)合(35條)，核酸轉(zhuǎn)錄因子活性(16條)，催化活性(6條)，轉(zhuǎn)運(yùn)子活性(6條)，信號(hào)傳感器活性(4條)(圖3: B)。ame-miR-bantam靶向的mRNA可注釋到33個(gè)條目，在生物學(xué)進(jìn)程大類中富集靶mRNA數(shù)量最多的條目是細(xì)胞進(jìn)程(116條)，代謝進(jìn)程(113條)，單組織進(jìn)程(95)，應(yīng)激反應(yīng)(42條)，信號(hào)(41條)；在細(xì)胞組分大類中富集靶mRNA數(shù)量最多的條目是細(xì)胞(69條)，細(xì)胞部分(69條)，細(xì)胞器(62條)，細(xì)胞膜(44條)，細(xì)胞膜部分(43條)；在分子功能大類中富集靶mRNA數(shù)量最多的條目是結(jié)合(154條)，催化活性(55條)，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(24條)，分子傳感器活性(23條)，信號(hào)傳感器活性(21條)(圖3: C)。

圖3 意大利蜜蜂工蜂蛹期ame-miR-13b(A), ame-miR-100(B)和ame-miR-bantam(C)靶mRNA的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，ame-miR-13b的靶mRNA可注釋到204條通路，包括代謝通路(56條)、嘌呤代謝(19條)、自噬-動(dòng)物(12條)、神經(jīng)活性的配體-受體相互作用(11條)和背腹軸的形成(8條)；ame-miR-100的靶mRNA可注釋到114條通路，包括FoxO信號(hào)通路(9條)、mTOR信號(hào)通路(7條)、Wnt信號(hào)通路(7條)、Hippo信號(hào)通路-果蠅(6條)和MAPK信號(hào)通路(5條)；ame-miR-bantam的靶mRNA可注釋到171條通路，包括代謝通路(30條)、Rap1信號(hào)通路(16條)、mRNA監(jiān)測(cè)通路(15條)、Wnt信號(hào)通路(12條)和cAMP信號(hào)通路(9條)。

2.4 ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam及共同靶mRNA在意大利蜜蜂工蜂蛹期發(fā)育過(guò)程的表達(dá)譜

RT-qPCR結(jié)果表明，ame-miR-13b在P1-P8階段總體表達(dá)趨勢(shì)為上調(diào)；在P1-P2階段上調(diào)表達(dá)，P2-P4階段略有下調(diào)，P4-P7階段持續(xù)上調(diào)，P7-P8階段轉(zhuǎn)而下調(diào)；P7時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高(圖4: A)。ame-miR-100在P1-P8階段總體呈上升趨勢(shì)；表達(dá)水平在P1-P3階段上升，P3-P4階段下降，P4-P8階段持續(xù)上升；在P8時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到峰值(圖4: B)。ame-miR-bantam在P1-P8階段總體上也呈上升趨勢(shì)；在P1-P8階段不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)趨勢(shì)與ame-miR-100基本一致(圖4: C)。此外，上述3個(gè)miRNA共同的靶mRNA XM_016916453.1在P1-P8階段總體表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)；在P7時(shí)表達(dá)量最高，P8時(shí)表達(dá)量最低(圖4: D)。

圖4 意大利蜜蜂工蜂蛹期ame-miR-13b(A), ame-miR-100(B)和ame-miR-bantam(C)及靶mRNA XM_016916453.1(D)的RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

2.5 意大利蜜蜂蛹期miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam與靶mRNA之間形成較為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖5)。分析結(jié)果顯示ame-miR-bantam靶向結(jié)合194條mRNA，數(shù)量最多；ame-miR-100靶向結(jié)合60條mRNA；ame-miR-13b靶向結(jié)合137條mRNA。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ame-miR-13b和ame-miR-bantam共同靶向調(diào)控NM_001011629.1, XM_006568833.2, XM_006571679.2, XM_006571681.2, XM_016915393.1和XM_016916690.1；ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam共同靶向調(diào)控XM_006563323.2, XM_006563325.2, XM_016916453.1和XM_016916455.1；此外，ame-miR-13b可同時(shí)靶向結(jié)合4個(gè)蛻皮激素相關(guān)mRNA(NM_001098215.2, NM_001159355.1, XM_006568053.2和XM_016913298.1)(圖5)。

圖5 意大利蜜蜂工蜂蛹期ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam及相應(yīng)靶mRNA間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

miR-13b, miR-100和miR-bantam已被研究證實(shí)參與調(diào)控蜜蜂(Ashbyetal., 2016)、家蠶Bombyxmori(Lingetal., 2015)和果蠅(Aboobakeretal., 2005)等昆蟲的變態(tài)發(fā)育過(guò)程。但意大利蜜蜂工蜂蛹期變態(tài)發(fā)育過(guò)程中ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam的調(diào)控作用迄今不明。本研究中，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室條件下模擬自然蜂群的內(nèi)部環(huán)境對(duì)意大利蜜蜂工蜂蛹進(jìn)行人工培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)P1-P8階段各日齡蛹的體色和眼色變化規(guī)律與自然蜂群巢房中工蜂蛹的體色和眼色變化規(guī)律一致(圖1)，證明了通過(guò)人工培養(yǎng)的方法將意大利蜜蜂工蜂幼蟲培養(yǎng)至蛹期具有可行性，為將來(lái)通過(guò)飼喂模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)探究蛹期發(fā)育中miRNA的分子功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Stem-loop RT-PCR結(jié)果顯示ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹變態(tài)發(fā)育階段(P1-P8)真實(shí)表達(dá)(圖2)，暗示三者對(duì)蛹期發(fā)育具有潛在的重要調(diào)控作用。Sanger測(cè)序結(jié)果顯示3個(gè)miRNA的序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的miRNA序列一致，證實(shí)了ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹中真實(shí)存在。此外，RT-qPCR結(jié)果顯示上述3個(gè)miRNA在意大利蜜蜂工蜂蛹變態(tài)發(fā)育過(guò)程總體上都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)(圖4)，進(jìn)一步說(shuō)明三者在蛹變態(tài)發(fā)育過(guò)程的重要性。

靶向預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam分別靶向調(diào)控850, 136和506條靶mRNA，這些靶mRNA均可注釋到細(xì)胞進(jìn)程、單一組織進(jìn)程、代謝進(jìn)程、細(xì)胞、細(xì)胞部分和結(jié)合等GO條目(圖3)，說(shuō)明上述3個(gè)miRNA潛在廣泛調(diào)控意大利蜜蜂工蜂蛹期的細(xì)胞生命活動(dòng)和新陳代謝過(guò)程。Hippo信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)昆蟲器官的生長(zhǎng)發(fā)育，并與影響細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等過(guò)程的Notch信號(hào)通路相互作用，進(jìn)而影響果蠅的眼、翅及其他器官的分化過(guò)程(Halder and Johnson, 2011; Kimetal., 2011; Kalkman, 2012; Barry and Camargo, 2013)。此外，Hippo信號(hào)通路還與Wnt, FoxO, mTOR和Jak-STAT等信號(hào)通路共同參與調(diào)節(jié)昆蟲的免疫應(yīng)答、腸道發(fā)育及卵巢發(fā)育等過(guò)程(Herranzetal., 2012; 郭睿等, 2018; 杜宇等, 2019)。本研究中，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示上述靶mRNA涉及Hippo, FoxO, Notch, Wnt和Jak-STAT等信號(hào)通路；其中ame-miR-13b的5條靶mRNA顯著富集在Jak-STAT信號(hào)通路；ame-miR-100的靶mRNA顯著富集在FoxO(9條)、mTOR(7條)、Wnt(7條)、Jak-STAT(4條)及Notch(3條)信號(hào)通路；ame-miR-bantam的靶mRNA顯著富集在Wnt(12條)、FoxO(8條)及Notch(7條)信號(hào)通路。以上結(jié)果表明上述3個(gè)miRNA調(diào)控相關(guān)靶基因表達(dá)對(duì)上述重要的生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響意大利蜜蜂工蜂蛹期的變態(tài)發(fā)育過(guò)程。

蛻皮激素(Ec)和保幼激素(JH)的共同作用可激活數(shù)十個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)而參與昆蟲的變態(tài)調(diào)節(jié)(Margametal., 2006)。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)對(duì)意大利蜜蜂4, 5和6日齡幼蟲腸道進(jìn)行small RNA-seq(sRNA-seq)和生物信息學(xué)分析，揭示ame-miR-13b和ame-miR-2等136個(gè)差異表達(dá)miRNA潛在參與調(diào)控意大利蜜蜂幼蟲的Ec滴度，使其與JH滴度保持動(dòng)態(tài)平衡，從而保證幼蟲的正常發(fā)育過(guò)程(熊翠玲等, 2018a)。miR-13b作為無(wú)脊椎動(dòng)物特有的miR-2家族的成員之一，參與德國(guó)小蠊B.germanica的變態(tài)發(fā)育過(guò)程，并調(diào)節(jié)家蠶成蟲翅發(fā)育，此外還與蜜蜂級(jí)型分化過(guò)程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ame-miR-13b可同時(shí)靶向結(jié)合4個(gè)與Ec相關(guān)的mRNA(NM_001098215.2, NM_001159355.1, XM_006568053.2和XM_016913298.1)；此外RT-qPCR結(jié)果顯示ame-miR-13b的表達(dá)水平在P2-P8階段呈動(dòng)態(tài)上升趨勢(shì)(圖4: A)。推測(cè)ame-miR-13b通過(guò)靶向蛻皮激素相關(guān)基因的表達(dá)，間接影響Ec的滴度，保證意大利蜜蜂蛹期的正常變態(tài)發(fā)育過(guò)程。背后的分子機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究。

黑色素與其他色素共同作用可形成昆蟲豐富的體色和斑紋(Wright, 1987)。yellow基因編碼的蛋白可與多巴以及酚氧化酶的共同作用形成多巴黑色素，進(jìn)而參與昆蟲的體色形成過(guò)程(崔坤蓉等, 2015)。前人研究發(fā)現(xiàn)yellow蛋白家族與調(diào)節(jié)蜜蜂級(jí)型分化以及生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的王漿主蛋白家族(MRJP)之間具有較近的進(jìn)化關(guān)系(李艷, 2007; 趙亞周等, 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，ame-miR-13b和ame-miR-bantam共同靶向yellow的mRNA(GenBank登錄號(hào): XM_006564945.2)，說(shuō)明二者潛在參與蜜蜂蛹期的體色變化及生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程。未來(lái)可根據(jù)本研究調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNA-mRNA靶向關(guān)系，進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲減技術(shù)深入探究miRNA調(diào)控意大利蜜蜂蛹期變態(tài)發(fā)育及其體色變化的分子機(jī)理。

綜上所述，本研究結(jié)合分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對(duì)ame-miR-13b, ame-miR-100和ame-miR-bantam在意大利蜜蜂工蜂蛹期(P1-P8)發(fā)育過(guò)程的表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和探討，結(jié)果表明上述3個(gè)miRNA的表達(dá)水平在蛹期發(fā)育過(guò)程中均呈動(dòng)態(tài)上升趨勢(shì)，并通過(guò)調(diào)控蛻皮激素相關(guān)mRNA和yellow基因的mRNA水平表達(dá)以及Hippo, FoxO, Wnt, Jak-STAT和Notch等信號(hào)通路潛在參與調(diào)節(jié)意大利蜜蜂工蜂蛹期的變態(tài)發(fā)育過(guò)程。研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探究意大利蜜蜂蛹期變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)理提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。