何培坤 段青蕊 高玉元 聶坤 郭曼莉 王麗娟 王麗敏

帕金森病(Parkinson disease，PD)是以中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性病變，多發(fā)于中老年人。PD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，研究表明多巴胺能神經(jīng)元死亡可能與α-突觸核蛋白毒性、神經(jīng)炎癥、線粒體凋亡等有關(guān)[1]。早期識別并啟動(dòng)疾病修飾治療是PD患者理想的治療方式，但目前臨床尚缺乏具有循證醫(yī)學(xué)依據(jù)、能夠緩解疾病進(jìn)展的疾病修飾治療藥物[2]。近來多個(gè)根據(jù)PD可能發(fā)病機(jī)制研發(fā)的、具有疾病修飾治療潛能的藥物臨床試驗(yàn)正在開展[3]，其中，艾地苯醌(idebenone)是潛在候選藥物之一。

艾地苯醌是輔酶Q10的合成物，其作用機(jī)制主要是保護(hù)線粒體膜電位、維持線粒體能量代謝作用以及抵抗氧化應(yīng)激等[4-5]。線粒體功能紊亂與氧化應(yīng)激在PD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有臨床研究結(jié)果顯示，多巴絲肼聯(lián)合艾地苯醌治療相對于單獨(dú)服用多巴絲肼治療能夠顯著改善PD患者的臨床癥狀[6]，其機(jī)制可能與艾地苯醌抑制神經(jīng)元凋亡有關(guān)[7]，但艾地苯醌通過何種途徑調(diào)控神經(jīng)元凋亡有待進(jìn)一步研究。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路是細(xì)胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與凋亡關(guān)系密切。PI3K是PI3K/AKT通路的上游因子，可通過磷酸化Thr308、Ser473位點(diǎn)激活A(yù)KT。AKT是重要的效應(yīng)激酶。被激活后的AKT可通過抑制與Bcl-2相關(guān)的促凋亡基因(Bcl-2 associated agonist of cell death gene，Bad)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、糖原合成酶-3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β)以及叉頭框蛋白O1(forhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)，激活抗凋亡蛋白-B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2樣因子1(Bcl-2 like 1，Bcl-xL)，從而抑制凋亡[8]。本研究通過構(gòu)建1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methy-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型，探討了艾地苯醌是否通過PI3K/AKT通路發(fā)揮治療PD的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只6周齡雄性C57BL/6J小鼠(SPF級)，體重19～21 g，由華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程遵守華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心相關(guān)規(guī)定，倫理號為2019034。小鼠置20～26℃、相對濕度為40%～70%環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)1周，自由飲水和進(jìn)食。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、PD模型組、艾地苯醌低劑量組和高劑量組，每組12只。

1.2 主要試劑艾地苯醌(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司)、MPTP(美國Sigma公司)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(Affinity Biosciences)、Bcl-2抗體、與Bcl-2相關(guān)的促凋亡調(diào)節(jié)因子X(Bcl-2 associated X，apoptosis regulator，Bax)、Caspase-3抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體(美國Cell Signal Technology公司)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Affinity Biosciences)。

1.3 方法

1.3.1PD模型制備：MPTP造模劑量參考Wang等[9]研究，艾地苯醌劑量參考Jiang等[10]研究。按體重30 mg/kg給予造模小鼠腹腔注射MPTP，連續(xù)5 d，建立亞急性PD模型，對照組以相同方式給予等量生理鹽水。于造模前5 d，分別按體重100 mg/kg和200 mg/kg給予艾地苯醌低、高劑量組小鼠艾地苯醌(用玉米油溶解)灌胃，連續(xù)11 d；正常對照組和PD模型組以相同方式給予等量玉米油。

1.3.2動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能評價(jià)：參考Zhou等[11]方法對所有小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，重復(fù)3次，取其均值。(1)爬桿實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備長50 cm的木桿裝置，將小鼠頭朝下置于桿頂部，記錄小鼠爬完木桿的時(shí)間。于灌胃給藥結(jié)束后，先對小鼠進(jìn)行爬桿訓(xùn)練2 d，然后正式進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)和倒掛實(shí)驗(yàn)。(2)倒掛實(shí)驗(yàn)：將直徑為5 mm的鐵絲水平放置，讓小鼠雙前爪抓住鐵絲，觀察10 s進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：四肢均能抓住鐵絲記4分；雙前肢和1個(gè)后肢抓住鐵絲記3分；雙前肢抓住鐵絲記2分；只有1個(gè)前肢抓住鐵絲記1分；無法抓住鐵絲記0分。

1.3.3免疫組化檢測：PD造模后1周，處死小鼠取全腦(每組取4只小鼠)，將全腦固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片，切片位置選取黑質(zhì)切面，每只小鼠取相同位置切片。切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、透化、封閉；加入一抗稀釋液孵育過夜；次日加二抗稀釋液孵育、DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)TH+神經(jīng)元(呈棕黃色)。以TH+神經(jīng)元代表存活的多巴胺能神經(jīng)元。

1.3.4Western blot檢測：PD造模后1周，每組取4只小鼠，將小鼠脫臼處死，冰上開顱取腦；加入RIPA裂解液提取組織蛋白，按照BCA說明書進(jìn)行蛋白濃度定量并調(diào)整蛋白濃度，100℃蛋白變性10 min；經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育后曝光顯色；Image J軟件采集PVDF條帶上的灰度值，分析腦組織Bcl-2、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism v 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Shapiro-Wilk法對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Brown-Forsythe檢驗(yàn)法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠行為學(xué)比較與正常對照組相比，PD模型組爬桿時(shí)間延長(P<0.01)，倒掛實(shí)驗(yàn)評分減少(P<0.001)；與PD模型組相比，艾地苯醌高、低劑量組爬桿完成時(shí)間縮短(均P<0.01)，艾地苯醌高劑量組倒掛實(shí)驗(yàn)評分增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)檢測結(jié)果比較

2.2 各組小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷比較與正常對照組相比，PD模型組黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少〔(127.3±9.3)個(gè)比(170.3±16.0)個(gè)；t=4.023，P=0.016〕；PD模型組及艾地苯醌高〔(169.7±6.1)個(gè)〕、低劑量組〔(149.3±4.7)個(gè)〕黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.63，P=0.001)，兩兩比較結(jié)果顯示，艾地苯醌高、低劑量組的黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)目均較PD模型組增加(均P<0.05)。結(jié)果見圖1。

2.3 各組小鼠Cleaved-Caspase-3/Caspase3及Bcl-2/Bax比值比較與正常對照組比較，PD模型組Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高(P<0.01)；與PD模型組比較，艾地苯醌高、低劑量組Bcl-2/Bax比值均增加(均P<0.05)，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值均明顯降低(均P<0.01)。結(jié)果見表2、圖2。

注：PD：帕金森病；TH：酪氨酸羥化酶

表2 各組小鼠Cleaved-Caspase-3/Caspase3及Bcl-2/Bax比值比較

注：PD：帕金森??；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；Bax：Bcl-2相關(guān)的促凋亡調(diào)節(jié)因子X；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

2.4 艾地苯醌激活PI3K/AKT信號通路與正常對照組比較，PD模型組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值降低(均P<0.01)；與PD模型組比較，艾地苯醌高劑量組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05)，而低劑量組p-PI3K/PI3K比值升高(P<0.01)。結(jié)果見表3、圖3。

表3 各組小鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值比較

注：PD：帕金森??；p-PI3K/PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶/磷脂酰肌醇3-激酶；p-AKT/AKT：磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B

3 討論

艾地苯醌是輔酶Q10的類似物，二者均有苯醌環(huán)樣結(jié)構(gòu)，所不同的是艾地苯醌水溶性更好，更容易透過生物膜和血-腦屏障[12]。艾地苯醌上的苯醌環(huán)結(jié)構(gòu)具有轉(zhuǎn)移電子的能力，能夠參與細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激以及保護(hù)線粒體膜電位的過程。已有多項(xiàng)研究報(bào)道艾地苯醌對PD的運(yùn)動(dòng)功能和學(xué)習(xí) 記憶功能有一定改善作用，其機(jī)制可能與艾地苯醌抵抗神經(jīng)炎癥[13]、減少脂質(zhì)過氧化、提高細(xì)胞抗氧化能力[14]以及增加線粒體自噬[15]有關(guān)。但艾地苯醌調(diào)控神經(jīng)元線粒體凋亡的機(jī)制仍未闡明。

該研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，PD模型小鼠運(yùn)動(dòng)能力下降，中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞減少，而艾地苯醌能夠改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，提高PD小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)，提示艾地苯醌可減少PD模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷，這與Yan等[13]研究結(jié)果一致。此外，該研究發(fā)現(xiàn)，低、高劑量艾地苯醌小鼠爬桿完成時(shí)間均值甚至短于與正常對照組，其原因可能與造模方式及實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)。有研究結(jié)果表明[16]，與正常對照組相比，MPTP誘導(dǎo)的PD亞急性模型小鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)功能損傷不甚明顯，從而增加實(shí)驗(yàn)誤差。

在PD中，細(xì)胞凋亡是多巴胺能神經(jīng)元丟失的重要病理機(jī)制。Bcl-2是抗凋亡蛋白之一，而Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵執(zhí)行者。有研究發(fā)現(xiàn)，MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠大腦中除黑質(zhì)區(qū)外，海馬區(qū)亦可出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡[17]，表明MPTP對黑質(zhì)區(qū)以外的其他腦區(qū)也有影響。本研究通過提取全腦組織研究發(fā)現(xiàn)，艾地苯醌可增加PD小鼠Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的激活，提示艾地苯醌可抑制MPTP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

PI3K/AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。AKT與PD發(fā)病關(guān)系密切，激活A(yù)KT可減少中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)艾地苯醌可增加PD模型小鼠腦內(nèi)PI3K、AKT的磷酸化水平，而激活的AKT可通過抑制Bad以及Caspase-9的激活抵抗凋亡[8]。除此之外，AKT還可通過調(diào)控自噬清除異常聚集的α-突觸核蛋白、減少神經(jīng)炎癥以及抵抗氧化應(yīng)激等方式保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[8]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示艾地苯醌可通過激活PI3K/AKT通路抑制神經(jīng)元凋亡，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)癥狀。但艾地苯醌治療PD的臨床療效，以及艾地苯醌調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路的具體機(jī)制仍需更多研究進(jìn)一步證明。