張向南，鄧偉，張松強，王宏宇，李雷，鞠文，周廣良，居發(fā)新，周正虎，李關興，巨積輝*，侯瑞興*

1.蘇州大學附屬瑞華醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215104；2.寶應縣人民醫(yī)院骨科，江蘇 揚州 225800

股骨頭缺血壞死是骨科難治性疾病之一，致殘率較高，每年新增病例數(shù)為15～20萬，且以青壯年為主[1～4]。股骨頭缺血壞死主要分為兩大類型，即創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性[5]。前者發(fā)生的主要原因為股骨頸骨折及醫(yī)源性引起的股骨頭的血供遭到急劇下降或中斷所致，后者主要的原因為皮質類固醇的應用或酗酒所引起的股骨頭血供緩慢下降所致[6]?？梢姽晒穷^缺血壞死的主要原因為股骨頭血供減少，使骨細胞和骨髓組織的壞死，進而繼發(fā)的骨形態(tài)學改變[7，8]。解剖學研究證實，股骨頭血供的主要來源是股骨頭支持帶動脈，占股骨頭總血供的70%[9]。目前有關股骨頭外的動脈研究較多且較為清楚，但對頭內動脈的研究較少。對于頭內動脈的研究，大多數(shù)采取的是影像學間接研究手段[10]。本研究通過顯微灌注頭內動脈后酸堿腐蝕，結合3D打印填充技術制作帶有頭內動脈的透明股骨頭標本，希望能為研究股骨頭內的血液供應提供一個直接的研究手段。

1 材料與方法

1.1 標本

3例帶髖周血管的離體豬股骨頭標本（豬齡8～12個月，平均10個月）。本研究經(jīng)蘇州大學附屬瑞華醫(yī)院倫理委員會批準，批準號：RX2019003。

1.2 試劑與儀器

環(huán)氧樹脂大紅色精混合液（環(huán)氧樹脂由東莞市小馬新材料科技有限公司提供），50%NaOH溶液（NaOH固體由上海麥克林生化科技有限公司提供），10%HCl溶液（38%HCl溶液由江蘇強盛功能化學股份有限公司提供），顯微鏡（鎮(zhèn)江市卓創(chuàng)醫(yī)療科技公司；AC220V/50Hz），手持3D掃描儀（型號：REEYEEPRO+，南京威布三維科技有限公司生產(chǎn)），3D打印機（廣州邁普再生醫(yī)學科技股份有限公司，型號：SLJ-JUPU 420）。

1.3 方法

1.3.1 分離插管 取帶有髖周血管的離體豬股骨頭標本，肉眼下沿髖臼打開關節(jié)囊，切斷股骨頭韌帶，去除髖臼。顯微鏡下在關節(jié)囊外尋找支持帶動脈的起源主干血管，根據(jù)血管口徑導入合適的頭皮留置針并結扎，注射少量肝素稀釋液并觀察股骨頭下滋養(yǎng)孔處的靜脈是否有血液流出以驗證插管是否成功。需要同時對后上、后下及前方3組支持帶動脈中的3根主干動脈進行插管，并結扎漏血分支血管。

1.3.2 沖洗灌注 3根主干血管分別用10 ml肝素鈉稀釋液沖洗排空股骨頭內動脈的血液后，以適當壓力注入環(huán)氧樹脂大紅色精混合液。過程中用止血鉗夾閉溢出鑄型劑的血管斷端，灌注結束后夾閉留置針軟管。

1.3.3 凝固及分離 灌注后的股骨頭置于常溫下凝固24 h。肉眼及顯微鏡下對股骨頭血管周圍組織進行初步分離，主要去除肌肉組織，注意保護血管的完整性。

1.3.4 堿腐蝕 已初步分離的股骨頭置于50%NaoH溶液堿腐蝕6 h，腐蝕液面須沒過大轉子，小轉子以及部分股骨干，以保證股骨頭標本軟組織徹底清除。堿腐蝕后顯微鏡下對血管周圍組織進行精細分離，并沖洗清潔股骨頭表面使之光滑。在小轉子下緣下方3cm用擺鋸進行股骨干截骨。

1.3.5 3D掃描并打印模具 堿腐蝕后的股骨頭立于掃描盤上，用手持3D掃描儀進行3D掃描，掃描完成后，在Wiboox Reeyee-Plus軟件上去除不相關部分后生成封閉模型保存為Obj格式，在Geomagic Studio 2014軟件上進行圈定所要打印的范圍導出stl格式，在Materialise Magics21.0中文版軟件上放大1.1倍并傳輸至3D打印機打印1 mm厚度的模具（圖1）。

圖1 3D掃描及打印結果1A：堿腐蝕后的實物圖1B：3D掃描結果1C：選取打印部分1D：選取的部分生成打印數(shù)據(jù)資料1E：打印的模具Fig.1 3D scanning and printing results1A:Physical drawing after alkali corrosion;1B:3D scanning results;1C:Selected the printing section;1D:Selected part to generate printing data;1E:Printed mold圖2 對股骨頭進行倒置酸腐蝕Fig.2 Inverted acid corrosion of femoral head

1.3.6 酸腐蝕及沖洗 取兩根1.5 mm克氏針穿大轉子平行于股骨頭頭頸交界線進行十字固定股骨頭，股骨頭倒置于250 ml燒杯中，加入10%HCl溶液，前3次液面低于頭頸交界線0.3 cm（圖2）。以后液面至頭頸交界處，每12 h進行顯微鏡下沖洗股骨頭一次，并更換10%HCl溶液。直至股骨頭骺板及其以外完全腐蝕，大約進行4～7個循環(huán)即可完全暴露頭內血管（圖3）。

圖3 股骨頭酸腐蝕沖洗過程3A：堿腐蝕結果3B：酸腐蝕第1次沖洗3C：第2次沖洗3D：第3次沖洗3E：第4次沖洗3F：第5次沖洗并去除雜物Fig.3 Acid corrosion and flushing process of femoral head3A:The result of alkali corrosion;3B:The first rinse of acid corrosion;3C:The second rinse;3D:The third rinse;3E:The fourth rinse;3F:The fifth rinse and removal of impurities

1.3.7 透明股骨頭的制作 3D打印模具安裝在已腐蝕好的股骨頭上，倒置固定模具及股骨頭后，從股骨頸邊緣的模具上注入新配置的環(huán)氧樹脂液體進行填充，靜置72 h后去除打印的模具，打磨股骨頭表面不規(guī)則區(qū)域并對股骨頭表面進行拋光直至表面光滑顯露骨內血管。

2 結果

2.1 股骨頭動脈鑄型標本清晰完整

本研究通過對離體豬股骨頭3根支持帶動脈主干同時進行環(huán)氧樹脂大紅色精混合液顯微灌注，酸堿腐蝕后得到完整的股骨頭內動脈血管網(wǎng)（圖4）。

圖4 股骨頭內動脈鑄型結果4A：前面觀4B：后面觀4C：斜正視觀Fig.4 Casting results of femoral head internal artery4A:Front view;4B:Back view;4C:Oblique front view

2.2 透明股骨頭完整復原了原股骨頭

應用3D打印技術，成功制成了能清晰觀察到頭內動脈結構的透明股骨頭（圖5）。為進一步研究股骨頭內動脈的分布規(guī)律，提供了堅實的基礎，也為長期保存股骨頭動脈鑄型標本，提供了更好的保障。

圖5 股骨頭骨內動脈鑄型水晶標本5A：前面觀實物照5B：3D打印模具后環(huán)氧樹脂填充5C,5D,5E：不同角度觀察股骨頭水晶標本 5F：上面觀實物照Fig.5 Cast crystal specimen of femoral head internal artery5A:The front view of material object;5B:Epoxy resin filling after 3D printing mold;5C,5D,5E:Crystal specimens of femoral head were observed from different views;5F:The above view of material object

3 討論

3.1 股骨頭內血管研究現(xiàn)狀

目前對于股骨頭外動脈研究較多且較為透徹[11]，主要原因為頭外血管較易暴露，可直視下研究。對于頭內動脈的研究，主要以間接方式進行研究。湛世本等[12]通過對頭內動脈灌注氧化鉍鑄混合造影劑后進行10%鹽酸脫鈣，然后對脫鈣的標本進行X線攝片，可獲取到頭內血管的一般信息，但難以顯示骨內動脈的吻合方式、管徑大小及頭內動脈的三維結構。邱興等[13，14]通過對離體豬股骨頭標本后下支持帶動脈顯微灌注明膠硫酸鋇懸浮液后進行顯微CT掃描，重建了頭內動脈的三維結構，使頭內滋養(yǎng)血管的位置、大小、走行走向及分支分布一目了然。但血管的顯示存在操作難度高、灌注不良及存在偽影等不足之處。對于頭內動脈的直視下研究，石小田等[15]通過對骨內動脈灌注乙酸乙酯+環(huán)已酮-過氯乙烯鑄型填充劑后進行堿腐蝕破壞骨小梁，然后用10%鹽酸進行脫鈣，用手術刀打開髓腔后觀察到骨內血管的走行、分布及吻合，但過氯乙烯填充劑質地較軟強度較小，難以保留血管原有的形態(tài)，且剝制雕刻法可能會對血管造成損傷。本研究把剝制雕刻法變?yōu)闆_洗法以減少對血管的損傷。使用環(huán)氧樹脂大紅色精混合液對骨內動脈鑄型，與傳統(tǒng)鑄型劑相比，環(huán)氧樹脂具有支撐性好且無毒等優(yōu)點，可獲取較為堅強的頭內動脈的立體三維結構。使頭內動脈的位置、走行特點、分支分布及相鄰血管吻合關系等清晰可見，便于直視下研究，彌補了傳統(tǒng)影像學重疊及偽影的不足。通過3D打印模具環(huán)氧樹脂填充把頭內血管固定于環(huán)氧樹脂中便于能夠較好的保持頭內血管的形態(tài)及標本輪廓的真實性，為科研教學提供良好的解剖學標本，也為長期保存股骨頭動脈鑄型標本提供了更好的保障。

3.2 股骨頭血管研究的意義

股骨頭的血液供應在股骨頭缺血性壞死的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，如創(chuàng)傷引起的股骨頭血供破壞、骨內高壓所致的微血流淤滯及微血管損傷等均是造成股骨頭壞死的重要因素[16]。因此，研究股骨頭頭內及頭外動脈的解剖學研究對股骨頭壞死性疾病的研究非常重要。目前對于股骨頭頭內動脈的研究，主要認為頭內動脈連接成網(wǎng)，相互溝通，且支持帶動脈與骺動脈網(wǎng)絡系統(tǒng)為股骨頭血供的重要來源[17]。經(jīng)過對股骨頭內動脈的鑄型研究，可獲取到股骨頭內動脈的立體結構，并對頭內動脈的三維結構從任意視角進行觀察，可對頭內血管的長度，方向，吻合情況進行定量研究。從鑄型的結果來看，股骨頭后上，后下及前方3組支持帶動脈在頭頸交界處進入股骨頭，每組有一支較粗的主干伴有1～2支的細小血管，支持帶動脈進入股骨頭后沿股骨頭的外圍走行，跨越骺板后近似垂直向股骨頭中心走行，走行中成輻射狀發(fā)出較多終末支營養(yǎng)股骨頭外圍，在股骨頭中心股骨頭內動脈以主干的形式進行吻合。這種頭內動脈的解剖學特點，保證了股骨頭內動脈的高度吻合性。

3.3 注意事項

離體帶有髖周血管的豬股骨頭標本的選擇為越新鮮越好，最好是離體未超過24 h的豬股骨頭標本。插管部位在旋股內外側動脈主干發(fā)出支持帶動脈主干的位置，這樣就保證了股骨頭支持帶動脈灌注的完整性。注射的壓力適當控制以免造成動脈破裂鑄型劑外露。鑄型劑攪拌應遵循慢速、均勻、長時間，以免產(chǎn)生氣泡影響灌注效果。鑄型劑配置后在60～90 min之間須灌注完畢，時間太短鑄型劑過稀較易流出，時間過長導致鑄型劑粘稠不利于灌注。3D打印的過程中需張貼一定的標志點，以免圖像丟失后能夠快速的同步圖像。

總之，結合3D打印的顯微灌注腐蝕法能夠較好的制作透明豬股骨頭內動脈鑄型標本，為以后的科研教學提供了良好的形態(tài)學基礎。由于本研究樣本量較少，尚不能對豬股骨頭內動脈的分布規(guī)律及形態(tài)特點進行歸納總結，有待后續(xù)深入研究。