吳亞輝，王韜甫，林洪啟*

1.河南省人民醫(yī)院麻醉科室，鄭州 450003；2.華中阜外醫(yī)院麻醉科室,鄭州 450003

當(dāng)冠心病等心血管疾病發(fā)展到一定階段，藥物緩解患者癥狀后，需要進(jìn)行外科手術(shù)或者介入治療，心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）不可避免。MIRI能夠?qū)е滦牡纳⑿螒B(tài)、結(jié)構(gòu)等發(fā)生改變，使患者出現(xiàn)心律失常、代謝障礙、血管內(nèi)皮功能損傷等心功能障礙[1]。研究表明心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)以致活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）富集導(dǎo)致的心肌細(xì)胞大量凋亡是MIRI最基本的病理改變[2]。最大限度地減輕由MIRI造成的心功能障礙，降低患者死亡率是臨床亟需解決的問題。右美托咪定是在ICU和臨床麻醉中廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛藥物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，作為一種高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，右美托咪定還具有抗焦慮、抗炎、抗氧化以及良好的器官保護(hù)作用[3]。羅建民等[4]報(bào)道在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療中，右美托咪定的應(yīng)用有助于患者術(shù)后心功能的恢復(fù)，減輕患者術(shù)中的MIRI損傷，體現(xiàn)了右美托咪定對(duì)心的保護(hù)作用。但關(guān)于右美托咪定對(duì)心保護(hù)作用的機(jī)制報(bào)道較少。蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（janus kinase 2/signaltransducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路在細(xì)胞生長、增殖、凋亡、分化、應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要作用，冷雪等[5]研究表明激活JAK2/STAT3通路能明顯改善急性心肌缺血大鼠的癥狀。本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，從心肌損傷以及心肌細(xì)胞凋亡的角度入手，探討JAK2/STAT3通路在右美托咪定對(duì)心保護(hù)作用的可能的機(jī)制，為右美托咪定的臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10周清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體重220～250 g，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心從鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司采購，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2017-0005。

1.1.2 主要試劑 鹽酸右美托咪定注射液（dexmedetomidine hydrochloride inject，2 ml：200μg，國藥準(zhǔn)字：H20090248，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；JAK2/STAT3信號(hào)通路特異性激動(dòng)劑SC-39100購自Sigma公司，HE試劑盒、DCFH-DA染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；p-JAK2，p-STAT3抗體、兔抗GAPDH購自美國abcam公司，TUNEL試劑盒、Western blot試劑盒購自德國Rebstock公司。

1.1.3 主要儀器 熒光顯微鏡（日本尼康公司），Biorad凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-rad公司），-80℃深冷冰箱（德國維根斯公司），電鏡（日本三菱公司），Leica RM2135組織切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 心缺血再灌注損傷大鼠模型構(gòu)建 術(shù)前12 h禁食，腹腔注射3 mg/L的10%水合氯醛將大鼠麻醉，以仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，備皮，消毒，連接電極（用以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的心電圖），參照文獻(xiàn)[6]切開頸部氣管，連接微小動(dòng)物呼吸機(jī)，開胸暴露心，以5/0線將左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，收緊線結(jié)后，肉眼可見其左心室壁呈現(xiàn)青紫色或蒼白色，血壓下降，波動(dòng)減緩，心電圖顯示ST段明顯抬高即為大鼠心肌缺血成功標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)扎30 min后剪開線結(jié)以再灌注120 min，心電圖顯示ST段呈現(xiàn)回落1/2以上即為再灌注成功。造模術(shù)后關(guān)胸、縫合傷口，腹腔注射少量青霉素預(yù)防感染。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行穿線不結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠術(shù)前1 h分別腹腔注射5.0μg/kg的右美托咪定、JAK2/STAT3信號(hào)通路激動(dòng)劑SC-39100[7]，假手術(shù)組、模型組大鼠注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 心彩超儀檢査大鼠心功能 再灌注120 min后，各組大鼠麻醉，微小動(dòng)物心彩超儀檢查各組大鼠的心功能。記錄左室收縮壓（1eft ventricular systohc pressure，LVSP）、左室舒張末壓（1eft ventricular enddiastolic pressure，LVEDP）、左室壓力上升最大速率（1eft ventricular pressure rise，+dp/dtmax）及左室壓力下降最大速率（1eft ventricular pressure drop，-dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠心肌組織病理檢查 檢查心彩超之后，將大鼠誘導(dǎo)麻醉，留取腹主動(dòng)脈血清5 ml，處死動(dòng)物。無菌剝離心，吸干水分，封存在液氮中，置于-80℃深冷冰箱中備用。取100 mg各組大鼠心肌組織，HE染色，切片，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.2.5 大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取100 mg各組大鼠心肌組織，經(jīng)固定，脫水，包埋，以及醋酸雙氧鈾（Uranyl Acetate）及枸櫞酸鉛（lead citrate）染色后，制成50 nm切片，干燥，電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)病理改變。

1.2.6 大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 將血液樣本離心，留取血清，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測(cè)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸磷酸激酶（creafine phosphokinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。

1.2.7 TUNEL染色檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡 取100 mg各組大鼠心肌組織，經(jīng)固定，冰凍切片，脫水，包埋后，按TUNEL試劑盒要求進(jìn)行反應(yīng)，漂洗，脫水，封片，熒光顯微鏡觀察。正常心肌細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)棕色[8]。使用Image 8.0圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析獲取各組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 DCFH-DA檢測(cè)大鼠心肌組織ROS水平 取100 mg各組大鼠心肌組織，10%聚甲醛固定2 h，石蠟包埋并切片，10μmol/L LDCFH-DA染色2 h，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.9 Western blot檢測(cè)大鼠心肌組織p-JAK2，p-STAT3表達(dá)水平 取100 mg各組大鼠心肌組織，常規(guī)裂解、勻漿、離心后，測(cè)定蛋白濃度，電泳分離，轉(zhuǎn)模、封閉，滴加一抗（均為1：500），4℃孵育過夜，次日清洗后加入二抗（均為1：1000），顯色，凝膠成像儀下讀取各條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心功能的影響

各組大鼠心彩超檢查如圖1示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低（P＜0.05），LVEDP明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高（P＜0.05），LVEDP明顯降低（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 彩超儀檢查各組大鼠心功能A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.1 Thecomparison of heart function of ratsin each groupA:Sham operation group;B:Model group;C:Experimental group;D:Control group Compared with the sham operation group,*:P＜0.05.Compared with themodel group,#:P＜0.05

2.2 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響

HE染色結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，胞核結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)容物豐富，細(xì)胞間質(zhì)無水腫、壞死現(xiàn)象，心肌纖維排列規(guī)則；模型組大鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及形態(tài)出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞腫脹，排列紊亂，核膜破損嚴(yán)重，胞核固縮明顯，胞膜或缺損或溶解，細(xì)胞間質(zhì)增大，炎性細(xì)胞大量浸潤，壞死的細(xì)胞增多，心肌纖維排列失去規(guī)則，呈現(xiàn)明顯的帶狀梗死灶；實(shí)驗(yàn)組大鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為正常，間質(zhì)稍見腫脹，炎性浸潤較模型組明顯減少，胞膜較為清晰，壞死的細(xì)胞數(shù)量較少；對(duì)照組大鼠的心肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，心肌纖維形態(tài)較為規(guī)整，細(xì)胞間質(zhì)稍微腫脹，細(xì)胞界限較為清晰。

圖2 各組大鼠心肌損傷病理 A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組Fig.2 Thepathology of myocardial injury in ratsin each group A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.3 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡下觀察各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)鐖D3所示：假手術(shù)組大鼠心肌橫紋清晰，心肌纖維排列規(guī)則，胞核性狀正常，線粒體嵴結(jié)構(gòu)、形態(tài)和數(shù)量正常；模型組大鼠心肌纖維出現(xiàn)大面積溶解現(xiàn)象，胞核明顯擴(kuò)大，核膜破裂，染色質(zhì)固縮明顯，線粒體數(shù)量減少，腫脹明顯，呈現(xiàn)空泡樣變性，嵴結(jié)構(gòu)變短、變疏、斷裂或缺失，膠原纖維松散排列；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞損傷明顯緩解，細(xì)胞排列趨于規(guī)則，線粒體損傷明顯減輕，部分嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨；對(duì)照組大鼠心肌纖維排列趨于規(guī)整，細(xì)胞稍見腫脹，少部分線粒體存在空泡樣變性，壞死病灶明顯減小。

圖3 各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變 A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組Fig.3 The ultrastructural changes of myocardial tissue in each group of rats A:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group

2.4 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠血清生化指標(biāo)的影響

ELISA結(jié)果如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中LDH、CK活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05），SOD活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠大鼠血清中LDH、CK活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯下降（P＜0.05），SOD活性明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠血清指標(biāo)比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.4 Thecomparison of serum indexesof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.5 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.5 Thecomparison of rat cardiomyocyteapoptosisin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.6 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌組織氧化應(yīng)激的影響

大鼠心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激以DCFH-DA染色法檢測(cè)ROS含量來評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖6所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，ROS含量明顯增多（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯減弱，ROS含量明顯降低（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 各組大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激的比較A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.6 The comparison of oxidative stress in myocardial tissue of rats in each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

2.7 右美托咪定預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果如圖7所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞的p-JAK2，p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞的p-JAK2，p-STAT3表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 各組大鼠心組織p-JAK2，p-STAT3蛋白的表達(dá)A：假手術(shù)組B：模型組C：實(shí)驗(yàn)組D：對(duì)照組 *P＜0.05，與假手術(shù)組相比#P＜0.05，與模型組相比Fig.7 Theexpression of p-JAK2 and p-STAT3 protein in heart tissueof ratsin each groupA:sham operation group;B:model group;C:experimental group;D:control group Compared with the sham operation group,*P＜0.05；Compared with themodel group,#P＜0.05

3 討論

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是患者在血運(yùn)重建中，心短期會(huì)出現(xiàn)缺血、缺氧，而恢復(fù)灌注后，心肌損傷并未緩解，反而加重的一種病理狀態(tài)。心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致心超微結(jié)構(gòu)改變、心功能障礙，再灌注時(shí)集聚的ROS會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞無端壞死，心肌收縮功能減退，尤其圍手術(shù)期的心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的心律失常甚至猝死[9]。因此尋找有效的手段或藥物抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌缺血再灌注損傷，是心肌缺血治療中亟需解決的重大課題。

研究表明缺血預(yù)處理能明顯緩解心肌缺血再灌注損傷，但是不同患者對(duì)不同藥物的吸收、耐受等原因限制了該治療手段在臨床的推廣應(yīng)用。眾多臨床醫(yī)師一直在尋找、研究、篩選合適的藥物。右美托咪定在1999年已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于重癥監(jiān)護(hù)病房患者的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛。近年來，右美托咪定因在圍手術(shù)期對(duì)器官的保護(hù)顯示了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，引起廣泛關(guān)注[10]。研究表明右美托咪定能明顯減輕重要臟器諸如腎、肝、腸道、肺、腦等的缺血再灌注損傷[11]。楊玲等[12]臨床研究表明右美托咪定預(yù)處理能明顯抑制心肌凋亡，在冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中減輕患者的心肌損傷。劉艷秋等[13]臨床觀察報(bào)道右美托咪定預(yù)處理在全麻手術(shù)中更能改善患者術(shù)后心的結(jié)構(gòu)損傷，顯示了良好的心保護(hù)作用。但是關(guān)于右美托咪定在心肌缺血再灌注應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，心彩超顯示模型組大鼠的心功能明顯降低，HE以及電鏡結(jié)果顯示模型組大鼠心呈現(xiàn)明顯的心肌缺血再灌注損傷。而經(jīng)右美托咪定預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組心功能明顯改善，病理損傷明顯緩解。LDH、CK的活性與心肌細(xì)胞膜的通透性關(guān)系密切，是衡量心結(jié)構(gòu)損傷的重要因素；患者血清中LDH、CK活性是臨床診斷心絞痛、心梗等心肌損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，是評(píng)價(jià)心血管患者遠(yuǎn)期預(yù)后的重要指標(biāo)[14]。本研究中實(shí)驗(yàn)組LDH、CK活性明顯降低，說明右美托咪定預(yù)處理能明顯改善心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷。

研究表明ROS異常集聚導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷心結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵因素[15]。Zhao等[16]研究證實(shí)下調(diào)氧化應(yīng)激的水平，減少ROS在細(xì)胞的積累，能明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌凋亡。Guo等[17]報(bào)道缺血預(yù)處理能降低心肌細(xì)胞的異常凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠的臟器損傷。本研究結(jié)果顯示經(jīng)右美托咪定預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中氧化應(yīng)激底物MDA的含量明顯降低，參與抗氧化還原的SOD的酶活性明顯降低，ROS含量、心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，說明右美托咪定預(yù)處理可抑制心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激，阻滯心肌細(xì)胞的凋亡，這與既往的研究結(jié)果一致。

JAK2/STAT3信號(hào)是機(jī)體內(nèi)涉及炎性、免疫、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種病理過程的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明細(xì)胞在激活JAK2／STAT3信號(hào)后，首先活化JAK2，進(jìn)一步將STAT3磷酸化，將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)至胞核，調(diào)控靶基因的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[18]。Xie等[19]研究證實(shí)在心肌缺血再灌注大鼠中，激活JAK2/STAT3信號(hào)能明顯增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡。Shang等[20]研究表明在缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞中，JAK2/STAT3信號(hào)的激活能明顯抑制細(xì)胞的氧化應(yīng)激，降低ROS積累。本研究將JAK2/STAT3信號(hào)激活劑用于對(duì)照組動(dòng)物中激活JAK2/STAT3信號(hào)，促進(jìn)JAK2和STAT3的磷酸化，以發(fā)揮對(duì)心的保護(hù)作用，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠的病理指征、血清指標(biāo)，以及其他指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組的差異不明顯。說明右美托咪定預(yù)處理對(duì)心的保護(hù)作用可能與JAK2/STAT3信號(hào)的激活有關(guān)。

綜上所述，右美托咪定預(yù)處理能明顯降低大鼠心肌缺血再灌注損傷，降低心肌細(xì)胞凋亡，可能與激活JAK2/STAT3信號(hào)，抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。但是對(duì)臨床上缺血再灌注損傷患者的應(yīng)用還需要更深入的研究。