龐漢青, 商瀟予, 魏 曄, 丁書文, 劉 量

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225000; 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高和病死率高等臨床特征[1]。中國(guó)人群的腦卒中發(fā)病率排在全球首位，其是導(dǎo)致居民死亡的首位病因[2]?！吨袊?guó)卒中中心報(bào)告2020》[3]揭示，腦卒中的發(fā)病率居高不下，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。臨床證據(jù)[4]表明，與西藥治療相比，中醫(yī)藥在腦卒中防治中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通脈顆粒由丹參、川芎和葛根共3味中藥組成，具有活血通脈之功效，臨床主要用于腦卒中、動(dòng)脈硬化、心絞痛和冠心病等心腦血管疾病治療[5]。通脈顆粒具有抑制神經(jīng)炎癥、抗氧化應(yīng)激和改善血液流變學(xué)等多重藥理作用[6-8]。通脈顆粒是治療腦卒中的核心中藥制劑，臨床療效確切，不良反應(yīng)較小[9]。但通脈顆粒治療腦卒中的藥效成分和潛在作用機(jī)制尚不清楚，制約了其臨床應(yīng)用。本研究擬采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS)技術(shù)對(duì)通脈顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)表征，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其抗腦卒中的作用途徑進(jìn)行初步探討，以期更好地指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

通脈顆粒(批號(hào)2110009)購(gòu)自葵花藥業(yè)集團(tuán)(唐山)生物制藥有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，由美國(guó)TEDIA公司提供。超純水由Mill-Q去離子水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)自制，其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

Waters Acquity超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，含在線真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵和WAD檢測(cè)器。SCIEX 4600高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)。KH-500DB型數(shù)控超聲儀, Centrifuge 5425R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。

1.3 樣品溶液制備

精密稱取1.0 g樣品至100.0 mL錐形瓶中，加入30.0 mL的75%甲醇水溶液, 100 Hz下超聲提取60 min; 冷卻至室溫, 75%的甲醇水溶液補(bǔ)足失重; 將提取液于13 000轉(zhuǎn)/min離心10 min, 取上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，于-20 ℃保存待用。

1.4 UHPLC-QTOF-MS分析

液相色譜條件: 色譜柱, Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100.0 mm, 1.8 μm); 流動(dòng)相: A為乙腈, B為0.1%甲酸水溶液; 進(jìn)樣量為2.0 μL; 流速為0.4 mL/min; 柱溫為40 ℃; 梯度洗脫程序如下: 0～1 min, 5% A; 1～5 min, 5%～12% A; 5～15 min, 12%～22% A; 15～22 min, 22%～38% A; 22～30 min, 38%～95% A; 30～32 min, 95% A; 32～32.1 min，95%～5% A; 32.1～35 min, 5% A。

質(zhì)譜條件: 采用DIA采集模式獲得MS和MS/MS數(shù)據(jù)，正、負(fù)離子模式掃描。離子化電壓為(+)5 000/(-)4 500 V; 離子源溫度(+)500/(-)450 ℃, 接簇電壓(DP)為(+)80/(-)80 V, 碰撞能(CE)為(+)35/(-)35 V; 噴霧氣(Gas 1)為55 psi, 輔助加熱氣(Gas 2)為55 psi, 氣簾氣為35 psi。一級(jí)質(zhì)譜母離子和二級(jí)質(zhì)譜子離子掃描范圍均為m/z50～1 500。

1.5 通脈顆?；钚猿煞值暮Y選

將從通脈顆粒鑒定的化學(xué)成分導(dǎo)入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)。以口服生物利用度(OB)和分子類藥性(DL)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出OB≥30.00%且DL≥0.18的化學(xué)成分作為通脈顆粒的活性成分。此外，通過文獻(xiàn)檢索的方法，考慮化合物在通脈顆粒中的含量及其生物活性，篩選通脈顆?；钚猿煞帧?/p>

1.6 通脈顆粒關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取

將通脈顆?；钚猿煞謱?dǎo)入TCMSP、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)和PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)挖掘。以“Stroke” “Cerebral ischemia” “Cerebral hemorrhage”為關(guān)鍵詞，分別通過PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、Comparative Toxicogenomics Database(CTD, http://ctdbase.org/)和Therapeutic Target Database(TTD, http://db.idrblab.net/ttd/)等數(shù)據(jù)庫篩選腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)。將化合物和腦卒中靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)基因名稱規(guī)范處理?；赩ENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es)平臺(tái)繪制化合物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，獲得通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。為表征通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵功效，將通脈顆粒治療腦卒中的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入CTD數(shù)據(jù)庫，匯總靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的功效。

1.7 蛋白與蛋白交互(PPI)網(wǎng)絡(luò)建立和關(guān)鍵靶標(biāo)分析

采用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)置為“Homo Sapiens”, 其他參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。基于Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建通脈顆粒治療腦卒中的PPI網(wǎng)絡(luò)，并采用軟件中自帶的NetworkAnalyzer工具包對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)洚悩?gòu)參數(shù)(degree、betweeness、closeness)進(jìn)行分析，確定PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。

1.8 “化合物-靶點(diǎn)”和“靶點(diǎn)-功效”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.1軟件分別構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”和“靶點(diǎn)-功效”互作網(wǎng)絡(luò)。通過分析“化合物-靶點(diǎn)”和“靶點(diǎn)-功效”網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)洚悩?gòu)參數(shù)，篩選通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵藥效成分、作用靶點(diǎn)和藥效。

1.9 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析和基因本體論(GO)生物功能注釋

將上述篩選到的交集基因?qū)隓AVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，對(duì)通脈顆粒治療腦卒中的作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析和GO功能富集分析。利用RStudio軟件以氣泡圖和條形圖的形式可視化處理通脈顆粒治療腦卒中的作用通路和涉及的生物功能。

2 結(jié) 果

2.1 通脈顆粒的化學(xué)成分鑒定

采用UHPLC-QTOF-MS方法，通過文獻(xiàn)查詢[10-12]、數(shù)據(jù)庫匹配和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，共從通脈顆粒中鑒定出96個(gè)化合物，正離子模式下鑒定38個(gè)，負(fù)離子模式下鑒定58個(gè)。UHPLC-QTOF-MS-的總離子流圖見圖1。通脈顆粒的化學(xué)成分以黃酮類、酚酸類、丹參酮類和苯酞類為主，其中黃酮類成分39個(gè)，酚酸類成分26個(gè)，丹參酮類成分17個(gè)，苯酞類成分9個(gè)和其他類成分5個(gè)。

2.2 通脈顆粒治療腦卒中的活性成分

通脈顆粒中活性化合物的篩選不僅根據(jù)化學(xué)成分的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)行為(OB≥30%; DL≥0.18), 也綜合考慮化合物在通脈顆粒中含量高低及其生物活性。以葛根中葛根素、大豆苷和染料木素為例，盡管這3個(gè)化合物的OB值均低于30%, 但葛根素、大豆苷和染料木素是葛根指標(biāo)性成分，且有明顯抗腦缺血活性[13], 因而也被確定為通脈顆粒活性成分。最終篩選到通脈顆粒中38個(gè)活性成分，其中丹參16種，葛根14種和川芎8種。見表2。

表2 通脈顆粒中活性成分

2.3 通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)

將篩選到的38個(gè)活性成分導(dǎo)入PubMed、PharmMapper和TCMSP數(shù)據(jù)庫，共檢索到通脈顆?；瘜W(xué)成分靶點(diǎn)254個(gè)。PharmGKB、CTD、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫共查詢到腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)453個(gè)。采用VENNY 2.1構(gòu)建通脈顆?；瘜W(xué)成分和腦卒中靶點(diǎn)的韋恩圖，共得到55個(gè)通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖2A)。分別對(duì)丹參、川芎和葛根的作用靶點(diǎn)取交集，得到3味藥的交集靶點(diǎn)8個(gè)(圖2B), 分別為核因子κB(NFκB)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、Toll樣受體4(TLR4)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)。

2.4 通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共包含52個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)和744條邊(edge)。以degree值大小篩選核心靶點(diǎn)，排在前列的靶點(diǎn)如下: 白細(xì)胞介素-6(IL-6, degree=38)、TLR4(degree=36)、IL-1β(degree=35)、腫瘤壞死因子(TNF, degree=34)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF, degree=34)、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3, degree=31)和HIF-1α(degree=30)等，這些靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中互作頻率較高，提示上述靶點(diǎn)可能是腦卒中治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.5 通脈顆粒的化學(xué)成分-腦卒中靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

通脈顆粒化學(xué)成分-腦卒中靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)見圖4, 該網(wǎng)絡(luò)共含有93個(gè)節(jié)點(diǎn)(化學(xué)成分38個(gè)，靶點(diǎn)55個(gè))和353條邊。采用“NetworkAnalyzer”插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析, degree值排名前10的活性成分為: P60(丹酚酸B)、P23(葛根素)、P26(大豆苷)、P69(染料木素)、P59(大豆黃素)、P94(丹參酮ⅡA)、P5(丹參素)、P75(藁本內(nèi)酯)、P82(洋川芎內(nèi)酯A)和P48(芒柄花苷); 前10位靶點(diǎn)依次為: 前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、核因子κB(NFκB)、胱天蛋白酶3(CASP3)、核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2(NRF2)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、BCL2相關(guān)X蛋白(BAX)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(BCL2)、腫瘤壞死因子(TNF)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)和VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)。以上結(jié)果表明，上述degree值較高的活性成分和靶點(diǎn)可能是通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵藥效成分和作用靶點(diǎn)。

2.6 通脈顆粒靶點(diǎn)-功效網(wǎng)絡(luò)分析

腦卒中的病理特征主要有神經(jīng)炎癥、神經(jīng)毒性、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、血腦屏障損傷、能量代謝紊亂等[14], 依次將這些靶點(diǎn)的功效歸為這些病理特征。通脈顆粒的靶點(diǎn)-功效網(wǎng)絡(luò)如圖5所示。通脈顆粒治療腦卒中的作用靶點(diǎn)主要富集在炎癥(degree=22)、凋亡(degree=16)、氧化應(yīng)激(degree=13)和神經(jīng)保護(hù)(degree=11)上，尤其是神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡富集的靶點(diǎn)最多，提示其主要通過抗炎和抑制凋亡途徑發(fā)揮抗腦卒中的作用。

2.7 GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析共得到549條生物過程(BP)、55條細(xì)胞組成(CC)和78條分子功能(MF), 排名前10位GO條目的結(jié)果見圖6。通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞交互、催化活性、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞死亡、神經(jīng)元凋亡的調(diào)控等生物過程; 主要涉及蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞連接、囊泡、線粒體和細(xì)胞膜等細(xì)胞組分; 主要參與蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、血紅素結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。

進(jìn)一步采用KEGG通路富集分析篩選通脈顆粒治療腦卒中可能涉及的信號(hào)通路，共得到29條顯著相關(guān)的信號(hào)通路(P<0.05)。富集排名靠前的信號(hào)通路主要包括缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、松弛素信號(hào)通路(Relaxin signaling pathway)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路(Neurotrophin signaling pathway)等。富集因子前20位的信號(hào)通路見圖7。KEGG通路分析表明，通脈顆粒主要通過抑制神經(jīng)炎癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮治療腦卒中的作用。

3 討 論

腦中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制涉及再灌注損傷、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等復(fù)雜的缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚[15]。目前，西醫(yī)尚無特效的治療方法，而中醫(yī)藥治療缺血性中風(fēng)具有整體調(diào)節(jié)、綜合治療、標(biāo)本兼顧的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[16]。通脈顆粒由丹參、川芎和葛根組成，其中丹參具有活血祛瘀、清心除煩的作用; 川芎具有活血化瘀、祛風(fēng)燥濕和行氣止痛之功效; 葛根具有升陽透疹、解肌退熱和止瀉的作用。諸藥合用可活血、行氣和養(yǎng)血，其被廣泛用于腦卒中的臨床治療。本研究利用UHPLC-QTOF-MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討了通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，通脈顆粒中丹酚酸B、葛根素、大豆苷、染料木素、丹參酮ⅡA和藁本內(nèi)酯等活性成分通過作用于PTGS2、NFκB、CASP3、NRF2和AKT1等靶點(diǎn)，在腦卒中治療中發(fā)揮重要作用。丹酚酸B和丹參酮ⅡA是丹參主要活性成分，丹酚酸B通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、清除氧自由基、促進(jìn)半影區(qū)VEGF的表達(dá)等途徑，有效改善血腦屏障損傷[17]。丹參酮ⅡA能夠顯著下調(diào)BCL2相關(guān)X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、胱天蛋白酶8(Caspase-8)等凋亡誘導(dǎo)因子的表達(dá)，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[18]; 并可降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥，減輕細(xì)胞黏附分子和白細(xì)胞浸潤(rùn)導(dǎo)致的腦損傷[19]。葛根素和染料木素是葛根主要藥效成分，葛根素通過抑制單核細(xì)胞因子和內(nèi)皮素分泌，減少腦梗死范圍，改善腦卒中患者神經(jīng)功能缺損[20]。染料木素通過抑制Ca2+超載、減輕谷氨酸神經(jīng)毒性、上調(diào)NRF2、HIF-1α等抗氧化蛋白表達(dá)，對(duì)腦卒中有顯著預(yù)防和保護(hù)作用[21]。藁本內(nèi)酯是川芎重要活性成分，可通過抑制TLR4-MAPK/NF-κB信號(hào)通路，減少炎癥相關(guān)酶及炎癥因子表達(dá)，減少缺血區(qū)腦梗死體積[22]。

KEGG富集分析結(jié)果表明，以PTGS2、TNF、VEGF、NFκB、NRF2、BAX和IL-6等為核心的通脈顆粒治療腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與了HIF-1、TNF、PI3K-Akt、IL-17、Relaxin和Neurotrophin等信號(hào)通路。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是機(jī)體低氧應(yīng)答狀態(tài)下的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過抑制氧化/硝化應(yīng)激、促進(jìn)血管生成等途徑改善半影區(qū)的腦梗死體積[23]。TNF-α和IL-1β、IL-6、IL-17等炎癥細(xì)胞因子具有促進(jìn)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷的作用[24]。PI3K-Akt通路是自噬的經(jīng)典通路，涉及神經(jīng)炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等重要生命過程，與腦卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。Neurotrophin信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活尤為重要，可通過激活Trk受體誘導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，增強(qiáng)突觸可塑性[26]。PTGS2參與局部缺血后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，服用PTGS2抑制劑可增加腦卒中病死率[27]。

綜上所述，通脈顆粒中有酚酸類、苯酞類、黃酮類和丹參酮類等成分，通過作用于PTGS2、HIF-1α、NFκB、NRF2、TNF和BAX等腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)，干預(yù)HIF-1、TNF和PI3K-Akt等信號(hào)通路，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥、降低氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而改善腦卒中癥狀。本研究從化學(xué)成分表征、靶點(diǎn)、功效、生物功能和信號(hào)通路等多角度探討通脈顆粒治療腦卒中的藥效成分和作用機(jī)制，可為通脈顆粒的臨床應(yīng)用和二次開發(fā)提供參考。