徐圓圓，賈黎明*，趙國春，陳 仲,4，趙田蕓，翁學煌

(1 北京林業(yè)大學 林學院省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2 北京林業(yè)大學國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心，北京 100083；3 北京林業(yè)大學無患子產(chǎn)業(yè)國家創(chuàng)新聯(lián)盟，北京 100083；4 北京林業(yè)大學林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；5 福建源華林業(yè)生物科技有限公司，福建三明 354500；6 福建省源容生物科技有限公司，福建三明 354500)

無患子(SapindusmukorossiGaertn.)屬于無患子科(Sapindaceae)無患子屬(SapindusLinn.)，是中國傳統(tǒng)的洗護用植物和藥用植物，其種仁含40%左右的脂肪酸，可用于制備生物柴油和高檔潤滑油[1]；果皮富含三萜皂苷(4.14%～27.04%)，可用于制作手工皂、洗發(fā)水等；無患子皂苷還具有抗菌、抗腫瘤、保護心腦血管系統(tǒng)、殺蟲等多種生物活性，在醫(yī)藥、日化、農(nóng)業(yè)等領域應用前景廣闊[2-3]。此外，無患子抗逆性強、樹型美觀、根系發(fā)達，夏花、秋葉和果實金黃，是中國南方園林綠化的重要樹種[4-5]。目前，中國無患子原料林培育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，福建、浙江及湖南等省份已培育近數(shù)十萬畝原料林，皂用產(chǎn)業(yè)及產(chǎn)品得到社會的高度認可[2, 6]。福建建寧縣2012年被授予“中國無患子之鄉(xiāng)”稱號，是中國發(fā)展無患子原料林的主要基地[7]。

目前，無患子研究主要集中在種質(zhì)資源收集和評價[2, 8]、開花結實習性[9-10]、原料林高效培育[11-12]，以及皂苷和油脂的提取、分離、鑒定與應用[1, 13-16]等方面。在果實生長發(fā)育方面，刁松峰[17]、邵文豪等[18]對浙江地區(qū)無患子果實生長規(guī)律進行了研究，并采用多項式對果實橫、縱側徑和鮮質(zhì)量生長動態(tài)進行了方程擬合。本團隊鄭玉琳等[19]對福建地區(qū)無患子果實成熟階段的果實性狀、種仁含油率和果皮皂苷含量的變化規(guī)律進行了初步研究，但未涉及整個果實生長發(fā)育進程。Logistic曲線是“S”型曲線，能很好地描述某些有界增長現(xiàn)象，目前Logistic模型已經(jīng)在越橘[20]、蘋果[21]、龍眼[22]、核桃[23]等果實的生長動態(tài)擬合中廣泛應用，但采用Logistic方程對無患子果實生長的模擬未見報道。另外，無患子果皮在抵御水分損失和病蟲害中起著重要作用，同時也是貯存主要活性物質(zhì)三萜皂苷的主要場所，張勤等[24]曾對無患子成熟時期干燥果皮的顯微結構進行了觀察，但關于無患子果實生長過程中果皮顯微結構變化的研究仍未見報道。因此，本研究以福建建寧縣無患子為材料，對其果實的生長發(fā)育規(guī)律進行了系統(tǒng)考察，并采用Logistic方程對果實生長發(fā)育動態(tài)進行曲線擬合，同時觀察生長過程中果皮顯微結構變化特征，確定無患子果實生長發(fā)育的重要時期，可為無患子的高效栽培管理和果實采收策略的制定提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料采自福建省三明市建寧縣無患子原料林(26°49′N，116°52′E)，樹齡10 a，株行距4 m×4 m，管理規(guī)范。于2018年6～11月進行果實樣品采集，在果園中選取3株樹體相近、生長健康、結果量穩(wěn)定的優(yōu)樹進行采樣，單株小區(qū)，重復3次。從花授粉后15 d開始測定果實的生長動態(tài)，從樹冠東西南北四個方向的中上部進行采果，采果量依果實大小而定。每隔15 d采樣一次，直至果實成熟。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實生長指標果實橫徑(FTD)、果實縱徑(FLoD)、果實側徑(FLaD)、種子橫徑(STD)、種子縱徑(SLoD)、種子側徑(SLaD)采用游標卡尺測量(圖1)，精確到0.01 cm；百粒果鮮重(FFM)、百粒果皮鮮重(FPM)、百粒種子鮮重(FSM)采用萬分之一天平測定，精確到0.1 mg，果皮和種子置于烘箱40℃烘干至恒重后，測定百粒果干重(DFM)、百粒果皮干重(DPM)、百粒種子干重(DSM)，并計算果皮含水率(MCFP)和種子含水率(MCFS)；百粒果體積(FV)、百粒果皮體積(PV)、百粒種子體積(SV)采用排水法測定；果實各生長指標均測定30個果，取平均值，3個技術重復，并計算凈增長量。相關計算公式如下：

果皮含水率=(百粒果皮鮮重-百粒果皮干重)/百粒果皮鮮重×100%；

種子含水率=(百粒種子鮮重-百粒種子干重)/百粒種子鮮重×100%。

圖1 無患子果實形態(tài)Fig.1 Fruit morphology of S. mukorossi

1.2.2 果實內(nèi)含物含量果皮總三萜皂苷含量(TSCP)采用香草醛-高氯酸比色法進行測定[25]；種子含油率(OCS)采用鄭玉琳等的方法進行測定[19]；并計算百粒果皮總皂苷質(zhì)量(TSMDP)和百粒種子含油量(OMDS)，計算公式如下：

百粒果皮總皂苷質(zhì)量=果皮總皂苷含量×百粒果皮干重；

百粒種子含油量=種子含油率×百粒果皮干重。

1.2.3 果皮顯微結構觀察取無患子新鮮果實赤道處果皮組織(所取組織大小依果實大小而定)固定于5% FAA中，3次重復，按常規(guī)石蠟切片技術進行切片制作[26]。用Olympus BX43F型光學顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)觀察所制切片并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2017軟件進行生長動態(tài)曲線和凈生長量曲線的繪制；采用R軟件進行相關性分析；采用SPSS 25.0軟件進行主成分分析，并采用Logistic方程模型對果實生長指標進行曲線擬合[27]，得到Logistics曲線生長過程中的3個關鍵拐點t1(始盛期)、t2(高峰期)和t3(盛末期)，t1之前為生長初期，t1～t3、t1～t2、t2～t3分別為速生期、速生期前期、速生期后期，t3之后為生長后期。

2 結果與分析

2.1 無患子果實生長發(fā)育進程

無患子果實由果皮和種子組成。果皮又可分為外果皮、中果皮和內(nèi)果皮。外果皮在各生長時期均具有蠟樣光澤，15～105 DAP (花授粉后天數(shù))期間為黃綠色，120 DAP開始轉(zhuǎn)色，150 DAP果皮為橙黃色；中果皮肉質(zhì)，75～105 DAP期間硬度較大、汁液豐富、有黏性，120～150 DAP期間中果皮變?nèi)犴g、似膠質(zhì)；內(nèi)果皮半透明、膜質(zhì)，在種子著生處有白色絨毛(圖2)。種子表面光滑，15～90 DAP期間，種皮顏色為綠色；105～150 DAP期間，種皮逐漸骨質(zhì)，顏色加深，最終變?yōu)楹谏?，種臍線形、附近附白色絨毛(圖2)。果實完全成熟時，果皮和種子分離。

圖2 無患子果實在不同生長發(fā)育時期的變化Fig.2 Fruit changes of S. mukorossi at different growth and developmental stages

2.2 無患子果實生長過程中直徑、質(zhì)量和體積生長變化動態(tài)

無患子果實和種子的橫、縱、側徑以及鮮重、干重和體積的生長總體上均呈“慢-快-慢”變化趨勢，為典型的單“S”型生長曲線(圖3)。其中，無患子果皮的鮮重、干重和體積在整個果實生長階段均比種子大(圖3，A)。果實和種子的橫、縱、側徑在生長過程中變化趨勢相似，均出現(xiàn)一個生長高峰 (圖3，B)；在105 DAP時，果實橫徑(24.61 mm)和側徑(21.62 mm)達到最大值，果實縱徑和種子橫、縱、側徑則在90 DAP達到最大值。百粒果、果皮、種子鮮重和百粒果、種子體積的凈生長量均在45～60 DAP階段最大(圖3，B)；百粒果、果皮、種子鮮重，百粒果、果皮、種子干重，以及百粒果、果皮、種子體積分別在105、120、90、135、135、135、105、135和90 DAP達到最高。

A.累積生長量；B.凈生長量圖3 無患子果實和種子直徑、質(zhì)量和體積生長變化A. Cumulative growth; B. Net growthFig.3 The diameter, mass and volume growth of fruit and seed of S. mukorossi

2.3 無患子果實生長過程中含水率及內(nèi)含物的變化特征

由表1可知，無患子果皮含水率、種子含水率、果皮總皂苷含量、百粒果皮總皂苷質(zhì)量、種子含油率、百粒種子含油量在不同發(fā)育時期間差異顯著。其中，無患子果皮和種子含水率均隨著果實的生長先增加后降低，分別在45 DAP和30 DAP時達到最高，分別為71.00%和81.91%；均在150 DAP時降至最低，分別為22.02%和14.90%。果皮總三萜皂苷含量在整個果實生長周期內(nèi)呈先增加后降低趨勢，先從15 DAP的12.30%增加至90 DAP的19.30%，此后下降，在120～150 DAP期間總皂苷含量相對穩(wěn)定(16.03%～17.03%)；百粒果皮總皂苷質(zhì)量隨著果實生長呈逐漸增加趨勢，在135 DAP達到最高；種子含油率和百粒種子含油量均隨著種子的生長逐漸增加，均在150 DAP時達到最大，在60～120 DAP階段種子油脂積累速度最快。

表1 無患子果實含水率和內(nèi)含物的變化

2.4 無患子果實生長指標Logistic方程擬合和綜合分析

2.4.1 生長方程模型擬合采用Logistic方程對無患子果實生長指標的生長模型進行曲線擬合，r在0.884～0.998之間，顯著性均達到顯著或極顯著水平，且不同指標各生長階段的起始時間及持續(xù)時間存在差異(表2)。其中，果實和種子橫、縱、側徑進入速生期和結束速生期的時間均較其他生長指標早，且達到生長高峰期(約30 DAP)的時間相近；百粒果、果皮、種子鮮重和體積進入速生期的時間相近，大概在35 DAP，百粒果、果皮、種子干重進入速生期的時間在50 DAP左右；百粒果皮鮮重、干重和體積到達生長高峰期的時間和速生期持續(xù)的時間均大于種子；百粒果皮總皂苷質(zhì)量和百粒種子含油質(zhì)量進入迅速積累期的時間分別為46和78 DAP，到達積累高峰期的時間分別為69和90 DAP，迅速積累期分別為47和26 d。

表2 無患子果實生長指標的Logistic模型

2.4.2 生長指標綜合分析無患子果實的21個生長指標間相關性分析結果表明，果實和種子的直徑、質(zhì)量、體積等指標間極顯著正相關；果皮總皂苷含量、百粒果皮總皂苷質(zhì)量、種子含油率、百粒種子含油量與果實直徑、質(zhì)量、體積等指標間也存在極顯著正相關性關系 (表3)。

表3 無患子果實各生長指標間的相關系數(shù)

同時，這些果實生長指標的主成分分析結果(表4)顯示，前2個主成分的累計貢獻率達93.320%。其中，第一主成分PC1包含了原始信息量的55.130%，其大小主要由種子橫、縱、側徑和百粒種子鮮重、體積決定，可以反映種子大小和鮮重狀況；第二主成分PC2包含了原始信息量的38.190%，其大小主要由種子含油率和百粒種子含油量決定，可以反映種子內(nèi)含物的積累狀況。依據(jù)相關性分析結果可知，無患子果實百粒種子鮮重分別與種子橫、縱、側徑以及百粒種子體積之間呈極顯著正相關，種子含油率和百粒種子含油量之間極顯著正相關，而百粒種子鮮重和種子含油率的測定方法相對簡便，所以可以用百粒種子鮮重和種子含油率來反映無患子果實的生長性狀。

表4 主成分分析旋轉(zhuǎn)后成分載荷矩陣

2.5 無患子果實生長過程中果皮顯微結構變化特征

不同生長時期無患子果皮結構大體相似，但細胞形態(tài)及大小存在差異(圖4, A)。無患子表皮細胞外被角質(zhì)層，呈透明帶狀，并嵌入表皮細胞間隙，角質(zhì)層隨果皮的生長不斷增厚；15～45 DAP期間，表皮細胞多為單層、類方形、排列整齊、間隙??；隨著果實生長，表皮細胞變?yōu)?～ 4層，形狀不規(guī)則，細胞變松散(圖4, B)。中果皮近表皮一側為6～12層厚角細胞，細胞呈卵圓形或長條形，相互重疊排列成板條狀，隨著果實生長厚角細胞逐漸變大，在果實成熟時變細長(圖4, B)；中果皮內(nèi)側是薄壁細胞和大量溶生式分泌腔，薄壁細胞在15～90 DAP期間呈近球形，鵝卵石狀排列，隨著果實生長體積逐漸增大、間隙變明顯，120 DAP時開始變形，果皮中部薄壁細胞扭曲，近內(nèi)果皮一側的細胞變細長，隨著果實成熟薄壁細胞變形加劇(圖4, A)；分泌腔隨著果實生長不斷增多、變大；外韌型維管束稀疏分布在薄壁組織中，在果實生長過程中維管束主要有4種類型(圖4，C)，生長初期的維管束結構分化不明顯(圖4，C,①)，隨著果皮的生長，維管束逐漸發(fā)育成熟，并在韌皮部外側分化出木化的纖維束(圖4，C，③～④)；此外，薄壁細胞中還含有眾多草酸鈣結晶和石細胞，草酸鈣結晶多為棱角尖銳的簇晶(圖4，D，①)，少數(shù)為方晶(圖4，D，②)，石細胞類圓形或不規(guī)則，細胞壁厚(圖4，D，③)。內(nèi)果皮由3～5層極扁平的木化細胞緊密層疊而成，隨著果實生長內(nèi)果皮結構上無明顯變化(圖4，D，④)。

A.不同生長時期果皮橫切面整體圖片，×4，圖中數(shù)字1-7分別表示外果皮、厚角組織、分泌腔、維管束、草酸鈣結晶、薄壁細胞和內(nèi)果皮；B.外果皮橫切面圖片，×40；C.中果皮中不同生長時期的維管束，①～④分別為15 DAP (×40)、45 DAP (×40)、75 DAP (×20)、90 DAP (×20)中存在的維管束，PC、P、X、FB、SC分別表示薄壁細胞、韌皮部、木質(zhì)部、纖維束、分泌腔；D.中果皮中的簇晶和內(nèi)果皮，①～④分別為簇晶×40 (105 DAP)、方晶×40 (30 DAP)、石細胞×40 (105 DAP)和內(nèi)果皮×40 (150 DAP)，CC、SCT、PC、SCL、Enp分別表示簇晶、方晶、薄壁細胞、石細胞和內(nèi)果皮圖4 無患子果皮不同生長時期的顯微結構A. Cross section of pericarp at different growth stages, ×4, numbers 1 - 7 indicate the exocarp, collenchyma, secretory cavity, vascular bundle, calcium oxalate crystal, parenchyma cell, and endocarp, respectively; B. Cross section of exocarp ×40; C. Vascular bundles in mesocarp at different growth stages: Fig. ① - ④ are vascular bundle at 15 DAP (×40), 45 DAP (×40), 75 DAP (×20), and 90 DAP (×20), respectively; PC, P, X, FB and SC represent parenchyma cell, phloem, xylem, fiber bundle and secretory cavity, respectively; D. Cluster crystal in mesocarp and endocarp: Fig. ① - ④ are cluster crystal at 105 DAP (×40), square crystal at 30 DAP (×40), sclereid 105 DAP (×40), and endocarp at 150 DAP (×40), respectively. CC, SCT, PC, SCL, and Enp represent cluster crystal, square crystal, parenchyma cell, sclereid, and endocarp, respectivelyFig.4 Microstructure of pericarp in S. mukorossi at different growth stages

2.6 無患子果實生長時期劃分及其外部形態(tài)和果皮顯微結構特征

根據(jù)果實生長指標變化規(guī)律和Logistic方程模型的擬合結果，可將無患子果實生長發(fā)育進程劃分為生長初期(0～30 DAP)、速生期(30～90 DAP)、生長后期(90～120 DAP)和果實成熟期(120～150 DAP) 4個階段，其具體外部形態(tài)及果皮顯微結構特征如表5所示。

表5 無患子果實生長過程中外部形態(tài)及果皮顯微結構特征

3 討 論

無患子果實各生長指標總體上呈現(xiàn)為“慢-快-慢”的單“S”型變化曲線，采用Logistic方程對其進行擬合，擬合系數(shù)在0.884～0.998之間，顯著性均達到顯著或極顯著水平，說明可以用Logistic方程對無患子生長節(jié)律進行擬合分析。根據(jù)Logistic方程模型得出了各生長指標生長過程中的關鍵時間點，無患子果實不同生長指標進入速生期/迅速積累時期、達到生長/積累高峰期和結束速生期/迅速積累時期的時間存在差異。果實和種子橫、縱、側徑到達生長高峰期的時間在30 DAP左右，說明果實和種子的直徑生長具有一定的同步性；百粒果實干重增長最快的時期晚于直徑、鮮重和體積，這與徐臣善等[21]、劉麗琴等[28]的研究結論相似。百粒果皮總皂苷質(zhì)量進入迅速積累時期、積累高峰期和結束迅速積累時期的時間分別為46、69和93 DAP，說明這些時間點是果皮中皂苷積累的3個關鍵點；百粒種子含油質(zhì)量進入迅速積累時期(78 DAP)和到達積累高峰期(91 DAP)的時間均最晚，可見無患子種子中油脂的積累主要在生長中后期完成。本研究中，無患子果實大部分生長指標間存在極顯著正相關性關系，說明無患子果實生長發(fā)育與其內(nèi)含物的積累具有很好的一致性；各生長指標間相互關聯(lián)，并表現(xiàn)出有順序、有節(jié)奏的變化趨勢[29]。對本研究中的21個指標進行主成分分析，可將其簡化為2個主成分，代表了原始數(shù)據(jù)93.320%的信息，最終確定百粒種子鮮重和種子含油率為無患子果實的關鍵性生長指標。

無患子果皮中富含生物活性成分三萜皂苷，是果實的重要組成部分。外果皮最外層為角質(zhì)層，對果實起著保護作用，其厚度還能影響果實的貯藏特性[30-31]；無患子角質(zhì)層隨著果皮的生長不斷增厚，可見無患子成熟果實耐貯性較好[32-33]。無患子內(nèi)果皮中的薄壁細胞在生長中前期形狀規(guī)則、排列緊密，隨著果實生長，薄壁細胞體積和間隙變大，使果實直徑、質(zhì)量、體積等不斷增加；果實生長后期，中部薄壁細胞變形，果皮變?nèi)犴g，這是由于果膠在果膠酶的作用下分解，細胞游離、失水變形；果皮中的淀粉、有機酸等被水解變成可溶性糖，高含量的蔗糖等可溶性糖的存在使得成熟的無患子果皮黏性較大[34]。無患子果皮中還含有許多大型溶生式分泌腔，是其三萜皂苷類物質(zhì)的貯藏場所；這些分泌腔在果實生長前期體積較小，但隨著果實的生長，細胞分泌物不斷增多，細胞破裂溶解形成腔穴或腔囊，在人參、三七、刺五加等富含三萜皂苷的植物中也具有類似的分泌腔[35]。無患子果皮薄壁細胞中還散布著許多草酸鈣結晶、維管束和石細胞等，這些結構可能起著防御、加強果皮機械支持能力、增強果皮抗脅迫能力等作用[36-37]，果皮中的維管束還與水分運輸相關[38]。

無患子果實生長初期(0～30 DAP)，從授粉受精到果實開始膨大，細胞分裂導致細胞數(shù)目增加，果實和種子橫、縱、側徑變化較快；此時可適當疏花疏果，并及時采用施肥、激素調(diào)控等措施進行穩(wěn)果[4]。果實速生期(30～90 DAP)，主要表現(xiàn)為果實的膨大，該時期是果實鮮重、干重和體積增加以及品質(zhì)形成關鍵階段；應注意加強樹體的肥水管理，以保證果實正常膨大[39]。果實生長后期(90～120 DAP)，果實體積、鮮重、干重增長速率變緩，果皮皂苷、可溶性糖和種子油脂含量增加迅速，主要表現(xiàn)為果實內(nèi)含物的積累和糖分的轉(zhuǎn)化[18]；該時期應保證樹體有較大的光合面積，以提高果實營養(yǎng)物質(zhì)積累與轉(zhuǎn)化，促進果實成熟；同時，這一時期也是無患子外觀品質(zhì)形成的關鍵時期，在做好追肥和病蟲害防治的同時，還應保持果園的通風等，以提高無患子果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。果實成熟階段(120～150 DAP)，果皮轉(zhuǎn)色、失水、皺縮，種子變黑、失水、變??；到果實完全成熟時(150 DAP)，果皮金黃、皺縮，種子與果皮脫離。鄭玉琳等[19]指出針對果皮皂苷和種仁油脂的用途，果實變?yōu)辄S色、果皮開始皺縮后的20 d內(nèi)是無患子的最佳采果期，與本研究中的135～150 DAP這一階段相對應。但根據(jù)無患子產(chǎn)地的生產(chǎn)經(jīng)驗，結合本研究結果，可以對無患子果實采收期進一步劃分：120～150 DAP均適合無患子采收果實，其中135 DAP為果實采收后進行果皮皂用的最佳時期，該時期百粒果皮總皂苷質(zhì)量最大，果皮含水率相對較低；150 DAP為果實采收后進行種子油用或果實綜合利用的最佳時期，此時果皮和種子含水率均降至最低，百粒果皮總皂苷質(zhì)量相對較大，百粒種子含油量最高。此外，還應該考慮果園當?shù)氐奶鞖鉅顩r，無患子在果實成熟期如遇大風或持續(xù)降雨天氣，容易導致大量落果，而且長期處在空氣濕度大的環(huán)境中，可能會使果實產(chǎn)生銹斑、裂果或發(fā)霉，影響果實外觀品質(zhì)，采收后也不利于貯藏，這種情況下可以考慮在最佳采果期前采收無患子果實。