陳文利 黃新亮 劉 輝 周小楠 潘中武 董博翰 （皖南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，蕪湖241000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌的發(fā)病率居于世界首位［1-2］。在各種病理類型的乳腺癌中，三陰性乳腺癌侵襲性最強，且預(yù)后較其他類型較差，目前的治療效果也不甚理想［3］。隨著現(xiàn)代科學(xué)的不斷進步，抗腫瘤免疫療法已逐漸應(yīng)用于各種癌癥的治療，并顯示了較好的治療效果［4］。其中腫瘤細(xì)胞裂解物（tumor cell lysate，TCL）是抗腫瘤免疫治療中常用的免疫細(xì)胞激活物。TCL含有腫瘤細(xì)胞中的各種腫瘤抗原和免疫活化蛋白因子，可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的發(fā)生，從而治療腫瘤［5］。但TCL在實際應(yīng)用過程中也面臨免疫激活能力不夠強，甚至可能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡的問題，這可能同TCL 中也存在免疫抑制物質(zhì)有關(guān)［6］。程序性死亡因子1（programmed cell death protein 1，PD1)是公認(rèn)的免疫檢查點分子，其配體細(xì)胞程序性死亡配體1（pro?grammed cell death protein ligand 1，PDL1）在多種癌癥中高度表達，PD1 與PDL1 結(jié)合，可引發(fā)PIK3CA/AKT 等信號通路的抑制，傳導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)信號，向下調(diào)節(jié)抗腫瘤、抗感染免疫，產(chǎn)生免疫逃逸促進腫瘤發(fā)生［7-11］。因此，TCL 對免疫細(xì)胞的活性產(chǎn)生的負(fù)面影響以及這種影響是否同PD1/PDL1 相互作用啟動免疫檢查機制有關(guān)值得探索。本研究將三陰性乳腺癌TCL 作用于T 淋巴細(xì)胞系H9，并用不同劑量的PD1/PDL1 抑制劑共同處理H9 細(xì)胞，以此探討TCL本身以及抑制劑PDL1 與PD1 結(jié)合后對H9 細(xì)胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國Clinx）；流式細(xì)胞儀（貝克曼CytoFLEX）；酶標(biāo)儀（美國Thermo）。

1.1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)液（美國Gibco）；胎牛血清（烏拉圭Lonsera）及雙抗，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 二抗（中國碧云天）；PD1/PDL1 抑制劑（美 國Selleck，PD1/PDL1 Inhibitor 3）；PD1 抗 體、PDL1 抗體及GAPDH 抗體、TNF-β 細(xì)胞因子檢測試劑盒（中國ABClonal）；PE 標(biāo)記的CD69 單克隆抗體（美國Thermo Fisher Scientific）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（中國凱基）；IL-2、IL-4（中國依科賽）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將MDA-MD-231 細(xì)胞及MCF-10A 細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。H9 細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每1～2 d換液1次，3～5 d 傳代1 次。細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。PBMC 取自正常人外周血，采用人淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)過簡單分離得到，倫理審批批號為：2020論審國研第（87）號。

1.2.2 231-TCL 的制備 取對數(shù)生長期的MDAMD-231 細(xì)胞計數(shù)并溶于PBS 溶液，每1×107個細(xì)胞溶于1 ml PBS，分別于-80 ℃冷凍15 min，于37 ℃融化5 min，振蕩1 min，為1個循環(huán)；反復(fù)凍融細(xì)胞5次。采用臺盼藍染色法檢測細(xì)胞凍融破裂情況，細(xì)胞全部死亡即為凍融細(xì)胞完成，得到231-TCL。

1.2.3 Western blot 檢測 收集各細(xì)胞后用適量裂解液裂解細(xì)胞，BCA 法測定蛋白濃度后，于10%的SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉膜，4 ℃濕盒中孵育相應(yīng)的一抗過夜，TBST 洗膜，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 二抗于室溫下孵育1.5 h，洗膜，避光條件下用適量化學(xué)發(fā)光液鋪展在膜上，于化學(xué)發(fā)光儀上顯影。通過Image J 軟件分析目的蛋白相對于GAPDH蛋白的灰度值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 以2.5×105個H9 細(xì)胞接種于12 孔板，待H9 細(xì)胞穩(wěn)定后加入不同劑量（MDAMD-231細(xì)胞數(shù)：H9細(xì)胞數(shù)分別為0.125：1、0.25：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1）的231-TCL，分別孵育24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞用于檢測231-TCL不同劑量對H9 細(xì)胞凋亡的影響；或加入同一劑量（MDA-MD-231 細(xì)胞數(shù)：H9 細(xì)胞數(shù)為2：1）的231-TCL 并加入不同劑量的PD1/PDL1 抑制劑，孵育48 h 后收集細(xì)胞用于檢測抑制劑作用后的231-TCL 對H9 細(xì)胞凋亡的影響。收集細(xì)胞后用PBS 洗滌2 次，再將其重新懸浮在500 μl 染色緩沖液中，用碘化丙啶（PI）和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）對細(xì)胞進行避光染色15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡。

1.2.5 細(xì)胞活化檢測 以2.5×105個H9 細(xì)胞接種于12 孔板，待H9 細(xì)胞穩(wěn)定后加入同一劑量的231-TCL 并加入不同劑量的PD1/PDL1抑制劑，孵育48 h后收集細(xì)胞，并用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，再將其重新懸浮在500 μl 染色緩沖液中，用PE 標(biāo)記的CD69 染料對細(xì)胞進行避光染色15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞檢測CD69。

1.2.6 ELISA 檢測 以2.5×105個H9 細(xì)胞接種于12 孔板，待H9 細(xì)胞穩(wěn)定后加入同一劑量的231-TCL，孵育48 h 后收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進行IL-2、IL-4、TNF-β細(xì)胞因子檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有實驗數(shù)據(jù)使用單因素差異分析法來進行分析。如兩樣本均數(shù)方差齊，采用t 檢驗進行比較；如兩樣本均數(shù)方差不齊，采用秩和檢驗或方差分析進行比較。對于兩個獨立樣本率，采用卡方檢驗進行比較。P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDL1 在MDA-MD-231、MCF-10A 細(xì)胞中及在H9、PBMC 中的表達 Western blot 結(jié)果顯示，MDAMD-231 細(xì)胞、MCF-10A 細(xì)胞中均可見PDL1 蛋白表達（圖1A），其中MDA-MD-231 細(xì)胞中PDL1 蛋白含量明顯較高（P＜0.01）；在H9細(xì)胞和PBMC中也檢測到PD1 蛋白存在（圖1B），在GAPDH 含量不變的情況下，H9 細(xì)胞中PD1 蛋白表達升高（P＜0.01）。其中，陰性對照BSA 中未見條帶，說明該PDL1 抗體和PD1抗體為特異性抗體。

圖1 MDA-MD-231、MCF-10A 細(xì) 胞 中PDL1 表 達 及H9細(xì)胞、PBMC中PD1表達Fig.1 PDL1 expression in MDA-MD-231 and MCF-10A cells and PD1 expression in H9 cells and PBMC

2.2 231-TCL誘導(dǎo)H9細(xì)胞凋亡的劑量-時間摸索通過流式凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，在24 h、48 h、72 h 3個時間點下，H9 細(xì)胞的凋亡大致遵循劑量依賴關(guān)系，隨著231-TCL 劑量逐漸增加，細(xì)胞凋亡增加（P＜0.01）。其中在24 h 作用時間點，231-TCL 在與H9 細(xì)胞數(shù)量比例為1：1、2：1、3：1 時，凋亡數(shù)基本無變化；在48 h作用時間點，231-TCL 在與H9 細(xì)胞數(shù)量比例為2：1時，凋亡數(shù)最多；而在72 h 作用時間點，仍然是細(xì)胞數(shù)量比例為2：1 時凋亡最高，但231-TCL 誘導(dǎo)H9 的凋亡數(shù)整體偏低（圖2）。綜合以上結(jié)果，選擇231-TCL 與H9 細(xì)胞比例為1：2，作用時間48 h 為最佳劑量-時間進行后續(xù)實驗。

圖2 231-TCL誘導(dǎo)H9細(xì)胞凋亡Fig.2 231-TCL induces H9 cell apoptosis

2.3 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用對H9細(xì)胞凋亡的抑制作用 為了驗證231-TCL 中PDL1對H9 細(xì)胞凋亡的影響，使用PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用H9 細(xì)胞，檢測H9 細(xì)胞的凋亡情況。流式結(jié)果表明，231-TCL 使H9 細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.01）。然而，PD1/PDL1 抑制劑共同作用后的H9 細(xì)胞，在低劑量5.6 nmol/L 時，細(xì)胞凋亡略有增加；隨著劑量增加，凋亡逐漸減少；但是當(dāng)劑量到達112 nmol/L 后，H9 細(xì)胞凋亡有明顯增加趨勢（P＜0.01），見圖3。

圖3 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用抑制H9 細(xì)胞凋亡Fig.3 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor inhibit H9 cell apoptosis

2.4 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用對H9細(xì)胞的活化作用 為了驗證231-TCL 中PDL1 對H9細(xì)胞活性的影響，使用PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL共同作用H9細(xì)胞，檢測H9細(xì)胞的活化情況，結(jié)果見圖4。流式結(jié)果表明，231-TCL 可對H9 細(xì)胞具有一定的活化作用（P＜0.01）。當(dāng)231-TCL 與PD1/PDL1抑制劑共同作用后，隨著劑量增加，H9 細(xì)胞的活化逐漸增加；但當(dāng)劑量到達112 nmol/L 后，H9 細(xì)胞活化效果有下降趨勢。

圖4 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用促進H9 細(xì)胞活化Fig.4 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor promote H9 cell activation

2.5 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用對H9細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、TNF-β 細(xì)胞因子的影響 收集231-TCL 與PD1/PDL1 抑制劑共同作用H9 細(xì)胞的上清液，應(yīng)用ELISA 實驗檢測上清液中的細(xì)胞因子情況，結(jié)果如圖5A、B 所示，231-TCL 可促進H9 細(xì)胞分泌IL-2、TNF-β，當(dāng)231-TCL與PD1/PDL1抑制劑共同作用H9細(xì)胞后，IL-2和TNF-β的分泌也有一定程度的增高（P＜0.05），劑量高于112 nmol/L 時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且IL-2 中效果最佳。作用前后IL-4的分泌并無明顯變化（圖5C）。

圖5 PD1/PDL1 抑制劑與231-TCL 共同作用影響H9 細(xì)胞因子分泌Fig.5 231-TCL with PD1/PDL1 inhibitor affect H9 cell cytokine secretion

3 討論

乳腺癌在我國有較高的發(fā)病率，并且具有相當(dāng)高的病死率，但目前的臨床治療效果不佳［12］。研究發(fā)現(xiàn)，通過TCL 可以致敏免疫細(xì)胞，進而產(chǎn)生抗腫瘤免疫作用［13］，因此如何讓TCL 更好的活化免疫細(xì)胞，是基于TCL 的抗腫瘤方法有效應(yīng)用的關(guān)鍵。TCL 作為細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)容物的混合物，其中包含免疫活化物質(zhì)，同時也勢必含有免疫抑制成分。本研究著眼于免疫檢查點分子PD1及其配體PDL1，探討三陰性乳腺癌TCL 通過PD1/PDL1 的相互作用對T淋巴細(xì)胞系H9細(xì)胞活性及功能產(chǎn)生的影響。

首先通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MD-231 中PDL1 表達明顯高于正常乳腺細(xì)胞MCF-10A，同時H9 中PD1 蛋白表達也明顯高于正常人PBMC。由于MDA-MD-231 細(xì)胞中PDL1蛋白的表達量較高，利用其制備的231-TCL 中也一定含有大量的PDL1 分子。而H9 細(xì)胞高表達PD1，則證明H9 細(xì)胞中存在PD1 免疫檢查機制啟動的分子基礎(chǔ)。

TCL 是抗腫瘤免疫治療中常用的免疫活化劑，但過去的研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞TCL 也能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MD-231 制備的231-TCL，能在適當(dāng)?shù)谋壤妥饔脮r間下誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞系H9 凋亡。凋亡的發(fā)生會使體外培養(yǎng)的H9 中的為TCL 激活的“有效細(xì)胞”數(shù)目大為減少，真正能轉(zhuǎn)變生成的抗腫瘤免疫細(xì)胞，因此也會出現(xiàn)下降，這十分不利于抗腫瘤免疫作用的產(chǎn)生。而且，TCL 如果能誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，也極有可能同時誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞、NK 等細(xì)胞發(fā)生凋亡，TCL 抗腫瘤的實用效果會被嚴(yán)重削弱。如何消除TCL 的這種凋亡誘導(dǎo)作用，顯得尤為重要。

為改善231-TCL的免疫活性，將PD1/PDL1抑制劑與231-TCL 共同作用于H9細(xì)胞，然后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果顯示：抑制劑劑量直至112 nmol/L時，H9 細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性逐漸減少。這說明當(dāng)設(shè)法阻止231-TCL 中的PDL1同H9細(xì)胞上的PD1結(jié)合后，免疫細(xì)胞的凋亡會出現(xiàn)減少。PDL1應(yīng)該是TCL誘導(dǎo)H9 凋亡的關(guān)鍵物質(zhì)。此外，當(dāng)抑制劑劑量高于112 nmol/L后，凋亡有升高趨勢。說明112 nmol/L應(yīng)該是抑制PD1/PDL1 相互作用的最佳劑量，而高濃度的抑制劑本身對免疫細(xì)胞有一定的傷害作用，可能也誘導(dǎo)了部分凋亡［15］。同上述誘導(dǎo)凋亡的結(jié)果相類似，PD1/PDL1 抑制劑聯(lián)合231-TCL 可以促進H9細(xì)胞表面CD69的表達、活化免疫細(xì)胞，抑制劑劑量到達112 nmol/L 時活化效果達到頂峰。CD69 是T 淋巴細(xì)胞激活后早期表達的表面抗原，當(dāng)其表達后，可作為共刺激信號促進T 細(xì)胞進一步活化和增殖，通過檢測CD69 可以驗證T 淋巴細(xì)胞是否被活化［16］。上述結(jié)果證明，231-TCL 中的PDL1 可誘導(dǎo)H9細(xì)胞凋亡、降低其活化；當(dāng)抑制了TCL中PDL1和H9 表面PD1 的結(jié)合，H9 細(xì)胞凋亡減少、活化增加，細(xì)胞活力得以顯著改善。

H9 細(xì)胞是一種CD4+T 淋巴細(xì)胞，其免疫學(xué)功能主要通過合成分泌細(xì)胞因子體現(xiàn)。因此，應(yīng)用ELISA 法檢測了H9 細(xì)胞因子的分泌量，發(fā)現(xiàn)231-TCL 作用H9 細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-2，TNF-β 分泌增加，說明231-TCL 本身可以活化免疫細(xì)胞。當(dāng)加入PD1/PDL1 抑制劑后，細(xì)胞因子IL-2，TNF-β 分泌進一步增加。IL-2 主要由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激T 細(xì)胞生長、活化，并誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化為Th1 輔助細(xì)胞，增強細(xì)胞免疫的殺傷作用［17-18］；TNF-β 是活化T 細(xì)胞和B 細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種生物調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞凋亡、增殖、分化等，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞等，從而抑制腫瘤的發(fā)展，這種細(xì)胞因子可以活化DC、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，促進這些細(xì)胞有效參與細(xì)胞免疫應(yīng)答［19］?？偟膩碚f，IL-2和TNF-β的分泌有利于細(xì)胞免疫的發(fā)生。抑制231-TCL 中的PDL1 和H9 細(xì)胞PD1 結(jié)合后，IL-2、TNF-β分泌量進一步增加的結(jié)果說明：231-TCL 中的PDL1對T 淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答是有抑制作用，抑制PDL1 和PD1 的結(jié)合則有助于細(xì)胞免疫應(yīng)答的恢復(fù)?？紤]到細(xì)胞免疫應(yīng)答是機體抗腫瘤的最主要方式，因此，PD1/PDL1 抑制劑和TCL 的聯(lián)合應(yīng)用或許可以誘導(dǎo)更強的抗腫瘤免疫作用。除了IL-2、TNF-β，還檢測了細(xì)胞因子IL-4，但是IL-4分泌量幾乎沒有變化。IL-4 也可由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生，但其免疫學(xué)功能與IL-2 有所不同，主要增強體液免疫途徑［20］。細(xì)胞因子IL-4 分泌無明顯變化表明：TCL中的PDL1 與PD1 結(jié)合后，主要會影響后續(xù)細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)生，而非體液免疫應(yīng)答。體液免疫并不是最主要的抗腫瘤免疫作用，因此體液免疫沒有增強，并不會顯著影響PD1/PDL1 抑制劑和TCL 聯(lián)用所誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌TCL本身對H9細(xì)胞具有活化和促凋亡的雙重作用。TCL 中PDL1 的存在有礙于TCL 發(fā)揮免疫活化作用，這同TCL 中的PDL1與H9細(xì)胞的PD1結(jié)合，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。將PD1/PDL1 抑制劑與TCL 聯(lián)用則能顯著提高TCL對H9 細(xì)胞的活化作用。這提示在體內(nèi)外使用TCL活化各種免疫細(xì)胞時，均可考慮加入PD1/PDL1 抑制劑，這是一種提高TCL 免疫活性的新穎有效的方式。在此基礎(chǔ)之上，今后還可進一步對TCL 通過PD1/PDL1 抑制免疫細(xì)胞功能的下游分子機制進行研究，進而通過靶向PD1/PDL1 免疫檢查點通路優(yōu)化TCL 對免疫細(xì)胞的活化，如將PD1/PDL1 信號通路中的信號分子抑制劑與TCL 聯(lián)用，以更好地活化免疫細(xì)胞。上述多種方式，均有望提高TCL 的抗腫瘤效果，可為臨床上三陰性乳腺癌治療提供更多的參考和解決方案。