魏文婕 賀立洋 尹 勤 劉理靜 周美玲 賀兼斌

（南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，懷化418000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種慢性、進行性、間質(zhì)性肺疾病，具有一定的破壞性，屬于纖維增殖性疾病范疇，其在影像學(xué)及病理學(xué)上的表現(xiàn)與普通型間質(zhì)性肺炎相同或相似，預(yù)后極差，平均存活期只有3～5年，五年存活率僅為20%，而病死率接近50%［1］。PF 的致病因素有很多，包括吸煙、感染、藥物不良反應(yīng)、毒物、自身免疫等，其發(fā)病機制主要與肺泡上皮細胞反復(fù)的損傷及修復(fù)有關(guān)，并有多種細胞因子及多條信號通路參與，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transform growth factor，TGF-β1）被認為是PF 發(fā)生過程中作用最重要的細胞因子之一［2］。果王素（中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸）為獼猴桃果仁提取的果仁油，主要成分為α亞麻酸，還含有維生素E及硒，既往研究顯示，果王素有抗炎、抗氧化、抗癌等作用，對多種疾病的防治具有極高的價值［3-4］。但其對PF的防治作用報道極少，本研究通過不同濃度果王素干預(yù)博萊霉素所致PF大鼠，在不同時間點觀察大鼠PF的病變程度，并測定羥脯氨酸（hydroxy?proline，HYP）、TGF-β1 蛋白及mRNA 含量，探索果王素是否通過調(diào)節(jié)TGF-β1 發(fā)揮抗大鼠PF 的作用，并探討其給藥濃度對大鼠PF的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性SD 大鼠128只，體質(zhì)量（210±15）g，清潔級，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2019-0014。

1.1.2 藥物和試劑 果王素（中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸含量600 g/L）購自湘西老爹生物有限公司，批號：XH20200921；博萊霉素A5 購自天津太河制藥有限公司；醋酸潑尼松片購自山東魯抗醫(yī)藥集團有限公司；HYP 含量檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔、兔抗山羊、山羊抗大鼠抗體購自美國Jackson公司；β-actin購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器 電子天平購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；脫水機、包埋機購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰實驗器材有限公司；移液槍購自Dragon 公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；感光膠片購自美國Kodak公司；掃描儀購自日本EPSON 公司；顯微鏡購自日本尼康公司；qRT-PCR 儀購自美國Roche 公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)采用美國自然基因公司提供的Alpha軟件。

1.2 方法

1.2.1 PF 模型的制備和分組處理 將128 只8 周齡的SD 大鼠隨機分為空白組（對照組）、模型組、潑尼松組（5 mg/kg）、果王素低劑量組（60 mg/kg）、果王素中劑量組（120 mg/kg）、果王素高劑量組（180 mg/kg）（劑量根據(jù)本課題組前期研究及相關(guān)文獻擬定［3，5］），其中空白組8 只，其余各組24 只。在SPF 實驗條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用20 g/L戊巴比妥鈉按45 mg/kg經(jīng)腹腔注入大鼠體內(nèi)進行麻醉，隨后無菌操作下行氣管正中切開，使大鼠氣管充分暴露，向除空白組外各組大鼠氣管內(nèi)注入5 mg/kg 博萊霉素A5（溶解于0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液中），并直立及旋轉(zhuǎn)大鼠，使藥物在其肺內(nèi)均勻分布，構(gòu)建PF模型，空白組則氣管內(nèi)注入0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液，其余操作同其他各組。于注入博萊霉素A5 后的第2 天開始進行藥物干預(yù)，空白組及模型組每天以0.9%氯化鈉2 ml 灌胃，潑尼松組用醋酸潑尼松5 mg/kg 溶入0.9%氯化鈉2 ml 中進行灌胃，果王素低、中、高劑量組分別以果王素60、120、180 mg/kg 加入2 ml 0.9%氯化鈉中進行灌胃，各組均每天灌胃1 次，共用藥28 d。除空白對照組外，各組大鼠于構(gòu)建PF 模型后第7、14、28 天分別處死8 只，空白組于28 d 全部處死。所有大鼠均采用斷頭法處死，并于無菌條件下開胸，分離留取肺組織，隨后將左肺組織凍存，用于HYP 含量和TGF-β1 mRNA 及蛋白表達的檢測，右肺組織經(jīng)主支氣管注入10%中性甲醛溶液充分?jǐn)U展，并于10%中性甲醛溶液中固定，用于肺組織病理學(xué)檢查。

1.2.2 HE 和Masson 染色觀察肺組織病理變化右肺組織行石蠟包埋后，以5 μm 厚度切片，再行常規(guī)HE 和Masson 染色，在光鏡下使用圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）行肺泡炎及PF評分［6］。肺泡炎評分：0 分為肺組織無炎癥細胞浸潤、間質(zhì)水腫及出血；1 分為肺組織炎癥浸潤＜20%；2 分為浸潤面積20%～50%；3分為浸潤面積＞50%并伴有嚴(yán)重肺組織結(jié)構(gòu)破壞。纖維化評分［7］：0 分為肺組織無纖維化；1分為擴大的肺泡及輕度增寬的間質(zhì)（≤正常3倍）面積＜20%；2 分為間質(zhì)輕度增厚但無肺組織結(jié)構(gòu)破壞；3分為間質(zhì)增寬（＞正常3倍）并伴纖維組織增多；4 分為肺組織輕度破壞及纖維化面積＜10%；5 分為纖維化面積占鏡下視野10%～50%；6分為肺組織嚴(yán)重破壞且纖維化面積＞50%；7 分為肺毀損及蜂窩肺；8分為大片彌漫性PF。

1.2.3 肺組織HYP 含量檢測 取適量左肺組織，于冰面上稱重、剪碎，按堿水法制備成10%肺組織勻漿，4 000 r/min 離心10 min 并提取上清液，將樣品pH調(diào)節(jié)至6.0～6.8。隨后取雙蒸水稀釋至10 ml，并取其中3 ml加入25 mg活性炭，混勻后以3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml。隨后向空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管中分次加入所需的雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)液、檢測液、試劑等，混勻后于60 ℃水浴15 min，冷卻后于3 500 r/min離心10 min，最后取上清液于波長550 nm處測定各管吸光度，并計算HYP含量。

1.2.4 免疫組化法檢測大鼠肺組織TGF-β1 取肺組織包埋于石蠟切片中，經(jīng)脫水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，用血清室溫封閉切片30 min，隨后加入一抗，并于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，次日滴加二抗，并于室溫孵育50 min，隨后通過DAB 顯色、蘇木精復(fù)染、脫水封片后，采用數(shù)字切片掃描儀獲取圖像，觀察染色結(jié)果，每個樣本分別取5 個不同視野，用Image-Pro Plus 6.0 進行半定量分析。

1.2.5 Western blot 法檢測肺組織TGF-β1 蛋白水平 取適量左肺組織，用RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)、BCA 法測蛋白濃度，通過SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜及脫脂牛奶封閉后，將HRP 標(biāo)記的山羊抗大鼠（一抗）稀釋1 000 倍，并于4 ℃孵育過夜，再用TBST在室溫下脫色搖床上洗3 次，5 min/次，將HRP 標(biāo)記的兔抗山羊（二抗）用TBST 稀釋3 000 倍，室溫下孵育30 min 后，用TBS 在室溫下于脫色搖床上洗3 次，5 min/次，將ECLA 和ECLB 兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF 膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1～2 min 后，去盡殘液，包好，置于暗匣中曝光。最后進行顯影和定影，并將膠片掃描存檔，Photoshop 整理去色，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值，得出TGF-β1蛋白相對表達量。

1.2.6 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測肺組織TGF-β1 mRNA 水平取50 mg 左肺組織，通過Trizol 試劑提取樣本RNA，隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并行PCR擴增，由武漢博爾夫生物科技有限公司依照表1 所示序列合成qRT-PCR 所用TGF-β1 引物（168 bp）。取10 μl cDNA 稀釋液于熒光定量PCR 儀中，在Bio-Rad CFX Manager 軟件上設(shè)定檢測，以GAPDH 為內(nèi)參照，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min，變性95 ℃10 s，退火60 ℃30 s，延伸65～95 ℃，0.5 ℃/5 s，共40 個循環(huán)，計算2-ΔΔCt值，從而分析TGF-β1 mRNA表達。

表1 qRT-PCR所用TGF-β1 引物序列Tab.1 TGF-β1 primers sequences used in qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有計量數(shù)據(jù)采用表示，多樣本均數(shù)間采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時則采用Dunnett T3 進行兩兩比較。數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件對實驗數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 果王素可改善PF大鼠肺組織炎癥及纖維化程度 空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，未見炎癥細胞浸潤及纖維化。各時間點下可見空白組外各組大鼠7 d 時炎癥反應(yīng)最為嚴(yán)重，14 d、28 d 時炎癥反應(yīng)逐漸減輕，HE 染色下，模型組大鼠肺組織7 d 時可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬，14 d時炎癥細胞較前稍有減少，肺泡間隔繼續(xù)增寬，并可見部分肺泡融合，28 d時炎癥細胞明顯減少，肺泡間隔增寬明顯，并伴有大量肺泡融合，肺組織結(jié)構(gòu)破壞。Masson 染色下，空白組僅見肺泡上皮細胞表面藍染，其余細胞及組織結(jié)構(gòu)清晰，模型組于7 d 時可見肺泡間隔增寬及少量點片狀藍染的膠原纖維形成，其改變隨時間逐步加重，28 d 時肺泡間隔進一步增寬，其內(nèi)可見藍染的團塊狀膠原纖維形成，并伴有肺組織破壞。各藥物干預(yù)組病理變化趨勢同模型組，但炎癥及纖維化程度較模型組均減低，以果王素高劑量組及潑尼松組最為顯著，見圖1、圖2。通過肺泡炎評分可得出，各藥物干預(yù)組評分均低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05），其中果王素高劑量組評分低于中、低劑量組（P＜0.01 或P＜0.05），而稍高于潑尼松組，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PF評分及HYP 含量測定對比，各藥物干預(yù)組PF 程度及HYP 含量均低于模型組（P＜0.01 或P＜0.05），果王素各劑量組之間，高劑量組效果最為明顯（P＜0.01或P＜0.05），其與潑尼松組相比，略高于潑尼松組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組肺泡炎評分、PF評分及HYP含量見表2。

表2 各組肺泡炎、PF評分及HYP 含量比較（xˉ±s，n=8）Tab.2 Comparison of alveolitis，PF scores and HYP content in each group（xˉ±s，n=8）

圖1 各組大鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

圖2 各組大鼠肺組織Masson染色（×200）Fig.2 Masson staining of lung tissue of rats in each group（×200）

2.2 果王素可減少大鼠肺組織TGF-β1 蛋白的表達 免疫組化TGF-β1 染色呈黃褐色或棕黃色顆粒分布于肺組織的各種細胞中，7 d時除對照組外各組肺組織TGF-β1 蛋白表達最高，其變化為隨時間推移逐漸減弱。各對應(yīng)時間點，模型組TGF-β1 蛋白表達最高，果王素高劑量組TGF-β1 蛋白表達明顯低于果王素中、低劑量組，但較潑尼松組稍高，見圖3。各組光密度分析儀半定量分析結(jié)果見表3。Western blot 檢測各組大鼠肺組織TGF-β1 蛋白表達與免疫組化結(jié)果基本一致，見圖4。

圖4 各時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達Fig.4 TGF-β1 protein expressions in lung tissue of rats in each group at each time point

表3 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白半定量分析（s，n=8）Tab.3 Semi-quantitative analysis of TGF-β1 protein in rat lung tissue at different time points（s，n=8）

表3 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白半定量分析（s，n=8）Tab.3 Semi-quantitative analysis of TGF-β1 protein in rat lung tissue at different time points（s，n=8）

Note：Compared with Blank group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.01；compared with Prednisone group，3）P＜0.01；compared with KFE-L group，4）P＜0.01；compared with KFE-M group，5）P＜0.01.

Groups Blank Model Prednisone KFE-L KFE-M KFE-H 7 d-0.47±0.031）0.27±0.022）0.44±0.022）3）0.33±0.032）3）4）0.29±0.022）4）5）14 d-0.45±0.031）0.23±0.022）0.41±0.032）3）0.30±0.032）3）4）0.25±0.022）4）5）28 d 0.14±0.03 0.41±0.041）0.19±0.032）0.37±0.032）3）0.29±0.042）3）4）0.21±0.042）4）5）

圖3 各組大鼠肺組織TGF-β1免疫組化（×200）Fig.3 TGF-β1 immunohistochemistry of rat lung tissue in each group（×200）

2.3 果王素減少TGF-β1 mRNA的表達 在模型組及各干預(yù)組中，大鼠肺組織TGF-β1 mRNA的表達在7 d 時最高，14 d 及28 d 逐步降低。各組中，空白組TGF-β1 mRNA表達最低，模型組表達最高，各藥物干預(yù)組中，潑尼松組及果王素高劑量組TGF-β1 mRNA表達明顯低于低劑量及中劑量組（P＜0.01），潑尼松組稍低于高劑量組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其表達與蛋白表達具有一致性，見圖5、表4。

表4 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA 的表達（s，n=8）Tab.4 Expression of TGF-β1 mRNA in lung tissues of rats in different time points（，n=8）

表4 不同時間點各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA 的表達（s，n=8）Tab.4 Expression of TGF-β1 mRNA in lung tissues of rats in different time points（，n=8）

Note：Compared with Blank group，1）P＜0.01；compared with Model group，2）P＜0.01；compared with Prednisone group，3）P＜0.01；compared with KFE-L group，4）P＜0.01；compared with KFE-M group，5）P＜0.01.

Groups Blank Model Prednisone KFE-L KFE-M KFE-H 7 d-1.46±0.031）0.95±0.022）1.36±0.032）3）1.27±0.032）3）4）0.98±0.062）4）5）14 d-1.35±0.031）0.86±0.032）1.26±0.022）3）1.21±0.032）3）4）0.88±0.032）4）5）28 d 0.67±0.04 1.28±0.031）0.79±0.032）1.18±0.032）3）1.01±0.052）3）4）0.82±0.032）4）5）

3 討論

PF 不僅是多種呼吸系統(tǒng)疾病的終末病理表現(xiàn)，也可以是單獨的一種疾病，其具體機制至今尚未明確，現(xiàn)階段雖從TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、NF-κB 等多條信號通路及Snail、ZEB、Twist、CTGF、Vimentin 等多種細胞因子對PF 進行研究，但用于臨床治療的卻只有少數(shù)［8-15］。TGF-β1被認為是PF 形成過程中作用最直接的細胞因子，多項研究表明，其可通過誘導(dǎo)成纖維細胞的增殖與分化、促進細胞外基質(zhì)合成、增加膠原蛋白沉積等作用推動PF形成與發(fā)展［16-19］。

在PF的產(chǎn)生與發(fā)展過程中幾乎都有TGF-β1的參與，其機制主要有：①抑制炎癥反應(yīng)［3］；②通過多條信號通路誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；③促進肺泡Ⅱ型上皮細胞向Ⅰ型上皮細胞轉(zhuǎn)變；④通過增加α-平滑肌肌動蛋白含量誘導(dǎo)肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化［20］；⑤通過刺激成纖維細胞合成ECM、抑制細胞外基質(zhì)降解酶（MMPs）的活性、增強細胞外基質(zhì)受體的表達，從而增加ECM 的形成并減少其降解。TGF-β1在被發(fā)現(xiàn)之初，便在體外試驗中被證實了其對哺乳動物損傷后的修復(fù)和膠原蛋白的沉積具有潛在作用，現(xiàn)在越來越多的研究表明，TGF-β1 在PF 發(fā)展過程中發(fā)揮樞紐作用，因此，通過TGF-β1 探索PF的形成機制至關(guān)重要。

既往研究表明，果王素具有降低血脂、減少炎癥細胞因子、減少肝臟丙二酰CoA 含量、增強機體免疫功能、抑制腫瘤細胞的增殖等作用［21］。但其能否通過調(diào)節(jié)TGF-β1起到抑制PF的作用暫未得到證實。本實驗結(jié)果顯示，通過博來霉素造模后，模型組在28 d中的病理變化符合PF的病理改變，表明造模成功。本研究中，除空白組外，其余各組大鼠肺組織在7 d、14 d、28 d 3 個時間點，可見其炎癥細胞浸潤在7 d 時到達高峰，但隨時間的推移逐漸減少，而肺泡的融合、間隔增厚及纖維化程度卻逐漸加重，可見大鼠肺組織炎癥浸潤隨著時間逐漸減輕，但其對肺組織的損害及纖維化卻呈進行性加重。通過肺泡炎及PF評分可見各干預(yù)組間，模型組大鼠肺組織損傷及纖維化程度最重，潑尼松組最輕，但與果王素高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，果王素各劑量組中，則是隨著劑量的增高，嚴(yán)重程度逐漸減低，且各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，HYP 作為PF 的定量評估指標(biāo)，與各組PF 的病理改變相一致，以上病理變化說明果王素對PF有治療作用，且使用高劑量時其治療作用在本研究中與激素作用相當(dāng)，除對照組外各組大鼠肺組織中TGF-β1 蛋白及mRNA 在第7 天時表達最為顯著，為3 個時間點表達的最高峰，且其表達隨時間的推移逐漸下降。各組間比較，空白組大鼠肺組織TGF-β1蛋白及mRNA表達始終低于其他各組，而模型組的表達最高，果王素干預(yù)組中，果王素高劑量組TGF-β1蛋白及mRNA表達最低，且隨劑量的減少，其表達逐漸增高。潑尼松組TGF-β1 蛋白及mRNA 的表達均低于果王素高劑量組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。說明果王素可能通過下調(diào)TGF-β1蛋白及mRNA表達抑制PF。

綜上所述，果王素可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1 發(fā)揮抑制PF 的作用，在本研究中其效果與激素相當(dāng)，果王素為中華獼猴桃果仁提取物，無激素副作用，這一研究為PF的治療拓寬了道路，但其是否能用于臨床治療還需進一步深入研究。