李潔羽 周智鋒 林萬松 陳淑萍 葉韻斌 （福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室，福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350014）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，由于HCC 患者免疫功能低下，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對放化療不敏感，導(dǎo)致總體治療效果不理想［1］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，過繼免疫治療（adoptive immunotherapy，ACI）可有效降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，且不良反應(yīng)低，相對安全，逐漸成為治療腫瘤的新型輔助或替代療法［2-3］。重組人纖維連接蛋白（RetroNectin，RN）主要來源于大腸桿菌中表達(dá)RN 的基因片段，是擴(kuò)增的人纖維連接蛋白的一種嵌合體，廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域［4-5］。相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí)，RN 能抵抗細(xì)胞高度活化誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞保持高分裂狀態(tài)從而促進(jìn)增殖，因此RN 與抗CD3 單抗相結(jié)合可高效地刺激細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖，從而獲得增殖率和活力更高的免疫活性細(xì)胞，即RAK細(xì)胞，其是臨床上細(xì)胞免疫治療常用的廣譜而有效的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

地西他濱（5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷，Decitabine，DAC）是一種胞嘧啶類似物，能夠競爭性地抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性，使DNA 去甲基化，再次激活表觀遺傳沉默基因，誘導(dǎo)細(xì)胞分化［6-7］。既往研究證實(shí)，體外誘導(dǎo)的NK 細(xì)胞經(jīng)DAC 刺激后，殺傷作用和因子分泌功能增強(qiáng)［8］。DAC 處理的嵌合抗原受體T（dCAR-T）細(xì)胞的增殖、抗腫瘤活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生均得到增強(qiáng)［9］。本研究將探討不同濃度的DAC短時刺激對RAK 細(xì)胞增殖、免疫表型及抗肝癌效應(yīng)的影響。體外藥物的加入可能是誘導(dǎo)培養(yǎng)具有更佳抗腫瘤特性的效應(yīng)細(xì)胞的一種策略，為過繼細(xì)胞免疫治療腫瘤提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞株HepG2 為本實(shí)驗(yàn)室保存。KBM-581培養(yǎng)基購自美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 購 自 美 國Hyclone 公 司；CD3 單 克 隆 抗 體（CD3McAb）、重組人白細(xì)胞介素2（recombinant hu?man interleukin-2，rhIL-2）購自PeproTech 公司；Ficoll-Paque 分離液購自GE 公司；鼠抗人淋巴細(xì)胞亞群試劑盒MultitestTMKit、Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、CD3-PerCP/CD8-APC/CD45RA-FITC/CD62L-PE Kit、IFN-γ-PE、顆粒酶-B（Granzyme B，GrB）-PE、穿孔素（perforin）-FITC、CD107a-PE、Intra?SureTM試劑盒、GolgiStopTM蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑購自BD公司；二辛5，6-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯（5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，

CFSE）細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Invitrogen 公司；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、離子霉素購自Sigma-Aldrich 公司；TC-20 自動細(xì)胞計數(shù)儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀購自BD 公司；Leica AF 活細(xì)胞工作站購自德國徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 RAK 細(xì)胞培養(yǎng) RN（12.5 μg/ml）和抗CD3 McAb（5 μg/ml）提前24 h 包被6 孔板，4 ℃冰箱放置過夜，使用前用培養(yǎng)基沖洗1 次。抽取3 例健康供者（已簽署知情同意書）外周血30 ml，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononu?clear cell，PBMC），生理鹽水洗滌。以含0.5%自體血漿的KBM-581培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，接種于6 孔板，加入IL-2（500 U/ml），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。后續(xù)培養(yǎng)根據(jù)情況每3 d 添加IL-2 及新鮮培養(yǎng)液。顯微鏡觀察細(xì)胞活力（活細(xì)胞應(yīng)＞80%），鏡下動態(tài)觀察RAK細(xì)胞增殖情況。

1.2.2 RAK 細(xì)胞分組及增殖實(shí)驗(yàn) RN 結(jié)合CD3McAb 包被6 孔板，將RAK 細(xì)胞分為6組接種于6孔板，3孔/組。初始細(xì)胞數(shù)3×106個/孔，其中以不加藥物的RAK 細(xì)胞為對照組，其他組為不同濃度的DAC（50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L）刺激組，藥物作用RAK 細(xì)胞24 h 后，全量更換新培養(yǎng)液，并加入IL-2 繼續(xù)培養(yǎng)，分別于4 d、7 d、10 d 和12 d 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，觀察不同濃度DAC 對細(xì)胞增殖的影響。CFSE是標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，在細(xì)胞分裂增殖過程中，染料可平均分配到子代細(xì)胞中，以CFSE 為細(xì)胞增殖示蹤物，調(diào)節(jié)RAK 細(xì)胞密度為1×106個/ml，每毫升細(xì)胞中加入2 μl CFSE 儲存液，終濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育10 min，加入5倍體積的冷培養(yǎng)基終止染色，冰上孵育5 min，300 g 離心5 min，沉淀細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌3 次后加IL-2 常規(guī)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第3、4、5 天收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀488 nmol/L激發(fā)光檢測CFSE細(xì)胞增殖。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞免疫表型分析 收集第4、7、10、12天的RAK細(xì)胞，調(diào)整各濃度組細(xì)胞數(shù)為5×105～10×105個，采用Multitest CD3-FITC/CD8-PE/CD45-Per?CP/CD4-APC、CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC、CD3-PerCP/CD8-APC/CD45RA-FITC/CD62LPE Kit（記憶表型）流式熒光抗體標(biāo)記細(xì)胞，4 ℃孵育30 min 后上機(jī)檢測RAK 細(xì)胞經(jīng)不同濃度DAC 刺激后的T細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）、NKT細(xì)胞（CD3+CD56+CD16+）比例。采用BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀的FACS DivaTM軟件進(jìn)行檢測，F(xiàn)lowJo7.6.1 軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 Annexin Ⅴ/PI檢測DAC 對RAK 細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度的DAC（0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L）刺激RAK細(xì)胞24 h后，分別于4 d、7 d、10 d、12 d 收集細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書加入Binding buffer 與FITC 標(biāo)記的Annexin-Ⅴ室溫避光30 min，再加入PI避光孵育5 min，1 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀檢測凋亡水平。

1.2.5 不同濃度DAC刺激對RAK細(xì)胞效應(yīng)功能的影響 培養(yǎng)第10天，收集各組不同濃度DAC刺激的RAK 細(xì)胞，調(diào)整濃度為2.0×105個/ml 置于96 孔板，加入50 ng/ml PMA、1 μg/ml 離子霉素刺激，培養(yǎng)基中含有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑GolgiStopTM，于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中共同孵育5 h 后收獲細(xì)胞，采用CD3-PerCP/CD8-APC 抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色。加入BD IntraSureTM試劑盒中Fix&Perm 破膜劑A 和破膜劑B 各100 μl，4 ℃下進(jìn)行胞內(nèi)染色，分別加入IFN-γ-PE、perforin-FITC、GrB-PE 各5 μl，避光孵育30 min，最終以PBS 洗滌后重懸，同時設(shè)置同型對照管。RAK 細(xì)胞表面溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome associated membrane protein 1，LAMP1，又名CD107a）表達(dá)的分析：收集培養(yǎng)第10 天的各組DAC 刺激的RAK細(xì)胞，按RAK細(xì)胞：HepG2靶細(xì)胞=10：1（1×106：1×105）在U 型底的96 孔板中充分混勻，然后向細(xì)胞混合物中加入5 μl CD107a-PE 抗體，2 h后加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑GolgistopTM（終濃度：10 μg/ml）溫和混勻后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，4 h 后收集細(xì)胞，按上述方法進(jìn)行表面染色，流式檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAC 刺激的RAK 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 6 種不同劑量DAC 刺激的RAK 細(xì)胞培養(yǎng)至第10 天時，顯微鏡下細(xì)胞大部分呈圓形，團(tuán)簇狀生長，隨著DAC濃度增大，細(xì)胞團(tuán)逐漸減少（圖1、圖2）。

圖1 RAK細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow chart of RAK cell culture

圖2 不同劑量DAC刺激的RAK細(xì)胞的生長狀態(tài)Fig.2 Growth status of RAK cells treated with different concentrations of DAC

2.2 DAC 對RAK 細(xì)胞增殖的影響 隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞總數(shù)逐漸增加，培養(yǎng)至第12天時，DAC高濃度組（2 000 nmol/L、3 000 nmol/L）與50 nmol/L 組相比，細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖3A）。如圖3B、C所示，RAK細(xì)胞在第4天快速增殖，添加不同濃度的DAC各組增殖率分別為（83.40±0.55）%、（82.4±3.30）%、（81.80±2.19）%、（79.50±3.46）%、（76.80±6.33）%、（71.40±6.78）%，DAC 3 000 nmol/L 組增殖率顯著低于DAC 50、500、1 000 nmol/L組（P＜0.05），提示DAC濃度越大，對細(xì)胞增殖抑制越顯著。

圖3 DAC對RAK細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of DAC on proliferation of RAK cells

2.3 DAC 對RAK 細(xì)胞免疫表型的影響 隨著培養(yǎng)時間延長，各組RAK 細(xì)胞CD4 比例呈上升趨勢，CD8 比例呈下降趨勢。與對照組相比，培養(yǎng)第10 天高濃度DAC 組（1 000、2 000、3 000 nmol/L）RAK 細(xì)胞CD4 比例顯著升高（P＜0.05），CD8 比例顯著降低（P＜0.05），見圖4。各組RAK細(xì)胞NKT（CD3+CD56+）比例隨培養(yǎng)時間延長呈上升趨勢，在第12 天，3 000 nmol/L DAC 刺激RAK 細(xì)胞組NKT 比例明顯升高（P＜0.01），見圖5。第10天收集各組RAK 細(xì)胞檢測記憶表型，發(fā)現(xiàn)CD4+或CD8+TCM（CD45RA-/CD62L+）表達(dá)隨DAC 濃度增加呈下降趨勢（P＜0.05），而CD4+或CD8+的TEM（CD45RA-/CD62L-）表達(dá)隨DAC 濃度增加呈輕度上升趨勢。同時比較CD4+TCM 與CD8+TCM 表達(dá)，可觀察到前者比例略高于后者（圖6）。

圖4 不同濃度DAC 刺激的RAK 細(xì)胞在不同時間點(diǎn)對CD4、CD8表達(dá)的影響Fig.4 CD4 and CD8 expressions of RAK cells in different DAC concentrations and time points

圖5 不同濃度DAC 刺激的RAK 細(xì)胞在不同時間點(diǎn)對NKT表達(dá)水平的影響Fig.5 NKT expression of RAK cells in different DAC concentration and time points

圖6 不同濃度DAC對RAK細(xì)胞記憶表型的影響Fig.6 Effects of different concentrations of DAC on memory phenotype of RAK cells

2.4 DAC 對RAK 細(xì)胞凋亡水平的影響 與對照組相比，隨著培養(yǎng)時間延長，高濃度DAC 刺激組（1 000、2 000、3 000 nmol/L）凋亡水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示DAC 濃度超過1 000 nmol/L 時可促進(jìn)RAK細(xì)胞凋亡（圖7）。

圖7 不同濃度DAC對RAK細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effects of different concentrations of DAC on apoptosis of RAK cells

2.5 DAC 對RAK 細(xì)胞效應(yīng)功能的影響 于培養(yǎng)第10 天收集不同濃度DAC 刺激的RAK 細(xì)胞檢測免疫效應(yīng)相關(guān)分子表達(dá)。圖8A 顯示，與其他DAC 濃度組相比，1 000 nmol/L DAC 刺激組IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。500 nmol/L 和1 000 nmol/L DAC 刺激組的perforin 表達(dá)高于0 nmol/L 和50 nmol/L DAC刺激組（P＜0.01）。500 nmol/L 和1 000 nmol/L DAC刺激組的GrB 表達(dá)略高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以HepG2為靶細(xì)胞，按效靶比10：1與RAK 細(xì)胞共孵育，流式細(xì)胞術(shù)檢測RAK 細(xì)胞表面CD107a 表達(dá)，圖8B 顯示，經(jīng)500、1 000 nmol/L DAC 刺激的RAK 細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)分子CD107a的陽性率較對照組提高更為明顯（P＜0.05）。

圖8 不同濃度DAC對RAK細(xì)胞毒活性的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DAC on cytotoxic activity of RAK cells

3 討論

過繼性免疫治療（adoptive cell transfer therapy，ACT）領(lǐng)域正在快速發(fā)展，以T 細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫治療受到廣泛關(guān)注，科學(xué)家們對如何優(yōu)化T 細(xì)胞的生成、提高T 細(xì)胞殺傷效率、減少T 細(xì)胞耗竭、開發(fā)通用型T細(xì)胞、減少腫瘤微環(huán)境抑制、降低臨床毒性等問題展開了深入研究［10-12］。RN 是重組人纖維連接蛋白片段，包括細(xì)胞結(jié)合域、肝磷脂結(jié)合域和CS-1位點(diǎn)3 個功能區(qū)域，包被在培養(yǎng)介質(zhì)上的RN 與CD3Ab 協(xié)同作用可有效刺激外周血T 細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖［13］。本研究采用RN 聯(lián)合CD3Ab包被后加入IL-2 共同刺激PBMC，獲得了上萬倍增殖的RAK細(xì)胞，大大提高了細(xì)胞培養(yǎng)效率。RAK細(xì)胞是廣譜的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在這個異質(zhì)性細(xì)胞群體中，主要的效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD8+細(xì)胞毒T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。目前為提高T 細(xì)胞制品的治療效果，許多研究主要集中于應(yīng)用藥物或細(xì)胞因子等進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)及條件優(yōu)化，提高效應(yīng)細(xì)胞的體外增殖水平及免疫活性。

DAC 是FDA 批準(zhǔn)的DNA 去甲基化劑，已被證實(shí)能夠抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，逆轉(zhuǎn)衰竭相關(guān)的DNA甲基化程序，從而在體內(nèi)外激活表觀遺傳沉默的基因［14-15］。本研究在體外添加不同濃度的DAC 對RAK細(xì)胞進(jìn)行短時刺激（24 h），然后充分去除藥物，在不同時間點(diǎn)觀察藥物作用后RAK 細(xì)胞的生長趨勢和免疫效應(yīng)活性。CFSE增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAK細(xì)胞在培養(yǎng)第4天快速增殖，高劑量的DAC，特別是3 000 nmol/L組增殖率顯著低于50、500、1 000 nmol/L DAC 組。細(xì)胞計數(shù)結(jié)果提示，隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞總數(shù)逐漸增多，到培養(yǎng)后期DAC 高濃度組（2 000、3 000 nmol/L）細(xì)胞數(shù)量顯著降低，提示DAC濃度越高，對細(xì)胞擴(kuò)增抑制越顯著。RAK 細(xì)胞群是以CD8+為主的細(xì)胞群，隨著培養(yǎng)時間延長，CD8+比例可達(dá)80%以上，盡管CD8+T 細(xì)胞是發(fā)揮腫瘤殺傷作用的主要細(xì)胞群，但CD4+T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)性和記憶維持性不容忽視，失去CD4+T 細(xì)胞的輔助會導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞耗竭［12］。因此不論是體外擴(kuò)增培養(yǎng)，或是基因工程改造的T 細(xì)胞，合適的CD4+/CD8+T 細(xì)胞都有利于二者相互協(xié)調(diào)共同發(fā)揮抗腫瘤作用［17］。在細(xì)胞制品中提高CD4+T 細(xì)胞比例，可能是提高過繼免疫細(xì)胞療效的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間延長，DAC 刺激的RAK 細(xì)胞CD4 和NKT 比例呈上升趨勢，CD8 比例呈下降趨勢，尤其是高濃度DAC（1 000、2 000、3 000 nmol/L）會促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞比例升高。但當(dāng)DAC 濃度超過1 000 nmol/L 時，會加速RAK 細(xì)胞凋亡。本研究通過記憶表型分析發(fā)現(xiàn)RAK 細(xì)胞以中央記憶型T 細(xì)胞亞群（CD45RA-/CD62L+）為主，CD4+或CD8+TCM 表達(dá)雖然隨DAC 濃度增加呈下降趨勢，但在DAC 刺激后CD45RA-/CD62L+的表達(dá)更集中于CD4 陽性而非CD8 陽性的RAK 細(xì)胞，提示DAC 有利于CD4+T 細(xì)胞TCM 生成，從而使其具備更加持久的抗腫瘤能力。本研究還發(fā)現(xiàn)低濃度DAC 不僅不影響細(xì)胞增殖，還能夠促進(jìn)細(xì)胞毒相關(guān)細(xì)胞因子分泌，特別是1 000 nmol/L DAC 刺激的RAK 細(xì)胞分泌的IFN-γ 和perforin 水平顯著升高。細(xì)胞毒效應(yīng)分子CD107a 的陽性率也顯著高于對照組，提示該濃度下DAC刺激的RAK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷作用明顯增強(qiáng)。

現(xiàn)有的研究表明，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMOL/LT3a）介導(dǎo)的新生DNA 甲基化不僅直接驅(qū)動T 細(xì)胞抑制和衰竭，DNA 甲基化也可通過改變多種免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平而導(dǎo)致T 細(xì)胞分化和活性的改變［15-16］。2013年，KOPP 等［8］發(fā)現(xiàn)使用的DAC 劑量不同會出現(xiàn)低甲基化和細(xì)胞毒性的雙相反應(yīng)，低濃度DAC 在細(xì)胞增殖過程中影響NK 細(xì)胞激活和抑制受體表達(dá)，高劑量DAC 降低NK 細(xì)胞增殖和活力。近期有研究采用低劑量（10～100 nmol/L）DAC 作用CAR-T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DAC 可啟動表觀遺傳重編程，賦予CAR-T 細(xì)胞增強(qiáng)和持久的抗腫瘤潛能，提供了一種體外給藥制備具有更好抗腫瘤特性的CAR-T 細(xì)胞的選擇［9，18］。該課題組一致認(rèn)為DAC 在一定劑量范圍內(nèi)可產(chǎn)生最佳免疫調(diào)節(jié)作用。而在本研究中，由于DAC作用的是RAK細(xì)胞，本研究推薦的作用于RAK 細(xì)胞的DAC 濃度為1 000 nmol/L，大大超過既往研究使用的劑量，考慮到也許是RN 能抵抗由于淋巴細(xì)胞增殖過程中高度活化而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，使活化細(xì)胞保持高分裂狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于快速增殖狀態(tài)，用較高劑量的去甲基藥物短時間刺激也可獲得更高的擴(kuò)增率、更合適的細(xì)胞亞群比例及更強(qiáng)免疫活性的效應(yīng)細(xì)胞。將藥物引入RAK 培養(yǎng)體系也為今后RAK 的臨床應(yīng)用提供良好的基礎(chǔ)借鑒，在此研究基礎(chǔ)上，課題組將進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DAC刺激的RAK 細(xì)胞的抗腫瘤療效，同時希望在基因組學(xué)水平研究DAC 對RAK 細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及免疫相關(guān)信號通路等的影響，也為改善過繼性T 細(xì)胞治療提供可參考的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。