唐碧蓉 黃敬春 石星亨 唐趙強(qiáng) 曾艷紅 陳麗欣 卓林娟 符文耀 王會(huì)娟 蔣淑榮

（1 廣東蔚徠實(shí)驗(yàn)室科技發(fā)展有限公司 廣東湛江 524000；2 廣東科誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室裝備有限公司 廣東湛江 524000；3 農(nóng)本科技（湛江）有限公司 廣東湛江 524000）

糖肽是一類(lèi)寡糖與多肽相結(jié)合的大分子化合物，糖肽在如糖肽類(lèi)抗生素和抗腫瘤疫苗的糖類(lèi)藥物研發(fā)中有著十分重要的應(yīng)用。糖肽合成難度較大［1-2］，國(guó)內(nèi)多以靈芝、云芝、納豆菌、人參等原料進(jìn)行提取，成本較高［3-7］；國(guó)外多以豬胃黏膜或豬十二指腸為原料進(jìn)行提取，成本相對(duì)低廉。廣東省年出欄生豬3 300萬(wàn)頭、年消費(fèi)生豬5 000萬(wàn)頭，是生豬生產(chǎn)和消費(fèi)的大省，具備制造糖肽的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)因糖肽提取效率不高，多為進(jìn)口，因此，有必要對(duì)硫酸糖肽生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化。本研究以豬十二指腸為原料，采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)提取溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行優(yōu)化，以期改進(jìn)國(guó)內(nèi)糖肽提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

豬十二指腸；丙酮（萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；氫氧化鈉溶液；醋酸溶液；氯化鈉；胰蛋白酶。

1.2 方法

1.2.1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，選定提取溫度（X1）70～100 ℃、時(shí)間（X）210～40 min、pH值（X）3為8～10，以粗品產(chǎn)量為指標(biāo)，運(yùn)用王玉方“均勻設(shè)計(jì)3.00軟件”，采用用U6*（64）均勻設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 糖肽提取

選取冰凍的豬十二指腸500 g絞碎成糜狀，置于燒杯中，加入500 mL水，按表1方案進(jìn)行堿解，然后用80%醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.7左右，冷卻。紗布過(guò)濾，向?yàn)V液加入0.5倍體積的丙酮，離心（3 000 r/min、15 min）；上清液中加入藥液體積4倍量的丙酮，分級(jí)沉淀，沉淀物用丙酮脫水2次。50 ℃真空干燥，得到堿解后糖肽。將堿解后粗品溶于500 mL純化水，加入15 g分析純氯化鈉，加入酶解后粗品質(zhì)量1%的胰蛋白酶，45 ℃、pH值8.5條件下酶解5 h，過(guò)濾，濾液分級(jí)、脫水、干燥，得到粗品糖肽。

2 結(jié)果與分析

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，應(yīng)用“DPS9.50標(biāo)準(zhǔn)版”軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析。

表1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.1 單因素影響分析

選用模型最大值為尋優(yōu)類(lèi)別，研究模型診斷（單因素影響）溫度、提取時(shí)間、pH值對(duì)提取率的影響。由圖1~3可以看出，隨著提取溫度的增加，提取率增加；隨pH值的增大，糖肽提取率增加；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率降低。當(dāng)提取時(shí)間為34 min時(shí)，提取率最低，可能原因是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，糖肽降解為小分子物質(zhì)。無(wú)法被非水溶劑沉淀；

圖1 不同溫度的提取率

圖2 不同時(shí)間的提取率

圖3 不同pH值的提取率

2.2 三因素綜合影響分析

采用“DPS9.50標(biāo)準(zhǔn)版”軟件進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為Y=-3.411 7+0.017 3X1-0.008 0X2+0.316 1X3，其中相關(guān)系數(shù)R=0.929，F(xiàn)值=4.219 1，回歸方程不顯著。各因素影響強(qiáng)弱順序?yàn)閜H（X3）＞提取溫度（X1）＞提取時(shí)間（X2），pH值為糖肽提取率的主要因素，提取時(shí)間和溫度為次要因素。

以粗品糖肽提取率為因變量，各因素為自變量，采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，回歸方程為Y=-1.299-0.005 08X2+0.000 827X2×X2-0.000 520X1×X2+0.003 320X1×X3。對(duì)方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.998，決定系數(shù)R^2=0.997，F(xiàn)值=81.07，p=0.083 1，說(shuō)明回歸方程有顯著意義。綜合提取實(shí)際情況，得出最佳提取工藝為溫度（X1）100 ℃，時(shí)間（X2）10.8 min，pH 值 （X3） 10.46，將X1、X2、X3值代入回歸方程，得出預(yù)測(cè)提取率為1.65%。

2.3 優(yōu)選工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)

取冰凍的豬十二指腸500 g共3份，分別按優(yōu)選的最佳提取工藝條件：溫度100 ℃，時(shí)間10.8 min，pH值10.46進(jìn)行提取酶解，稱(chēng)取糖肽粗品重量，并計(jì)算糖肽的提取率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分別為1.52%、1.40%、1.56%，平均值為1.49%，與回歸方程的預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明此提取工藝穩(wěn)定。國(guó)外相關(guān)技術(shù)提取條件為100 ℃、15 min、pH值9.2，其粗品糖肽的提取率為0.65%。本優(yōu)化工藝糖肽的提取率比國(guó)外相關(guān)技術(shù)提取率高出100%。

2.4 糖肽檢測(cè)

將本優(yōu)化工藝獲取的粗品糖肽經(jīng)純化、磺化、再純化，與GENTIUM公司的硫酸糖肽樣品對(duì)比。研究結(jié)果顯示，本優(yōu)化工藝所得粗品糖肽經(jīng)處理后獲得的硫酸糖肽中總硫含量為15.406%，屬于較高水平，說(shuō)明本優(yōu)化工藝獲得的粗品糖肽質(zhì)量較高。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)優(yōu)化從豬十二指腸中提取糖肽工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖肽最佳提取工藝為提取溫度為100 ℃，提取時(shí)間為10.8 min，pH值10.46。堿解和酶解是影響糖肽提取的關(guān)鍵步驟，堿解前所用冰凍豬十二指腸應(yīng)盡量粉碎，顆粒度越小，越有利于糖肽的提取，同時(shí)需要保證各試驗(yàn)中原料粉碎度相同，盡量減少其他因素對(duì)糖肽提取影響；堿解時(shí)在溫度未達(dá)到設(shè)定值前，將提取液調(diào)至中性，減少試驗(yàn)誤差。堿解產(chǎn)物應(yīng)盡量去除丙酮，否則會(huì)影響酶的活性。