楊建國 楊紅利 王樂

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是臨床上一種特殊的乳腺癌分子亞型，占所有乳腺癌10%～20%[1]。因其雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone,PR)和人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)三者均為陰性表達(dá)，缺乏內(nèi)分泌治療及抗HER-2的分子靶向治療的相應(yīng)靶點(diǎn)，給治療上造成了較大困難。TNBC具有組織學(xué)分級高、分期晚、腫瘤侵襲性強(qiáng)、早期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高等臨床特點(diǎn)，預(yù)后往往較差，5年生存率<30%[2-4]。TNBC的分子標(biāo)志物表達(dá)仍不明確，尋找有效的生物標(biāo)志物來篩選不良預(yù)后病人成為臨床急需解決的問題。

既往多個(gè)研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在乳腺癌組織中處于高表達(dá)狀態(tài)，與乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加、放化療抵抗、免疫逃逸、預(yù)后不良相關(guān)[5-6]。c-myc作為發(fā)現(xiàn)較早的原癌基因之一，在乳腺癌和其他腫瘤的許多研究中均為高表達(dá)[7-9]，但c-myc在TNBC這一特殊亞型乳腺癌中的表達(dá)情況及其預(yù)后價(jià)值少見報(bào)道。因此，本研究檢測HIF-1α及c-myc在TNBC中的表達(dá)，并探究其對臨床病理參數(shù)的影響，基于列線圖建立TNBC的術(shù)后生存預(yù)測模型。

對象與方法

一、對象

本研究選用包含161例TNBC病人臨床及隨訪數(shù)據(jù)的組織芯片(芯片來源：中科光華智能生物科技有限公司，編號：BRC1657)，隨訪時(shí)間為2016年7月至2019年12月。年齡30～81歲，平均(51.2±17.3)歲，中位年齡為52歲。腫瘤直徑>2 cm者91例；術(shù)后病理組織學(xué)Ⅰ級10例，Ⅱ級87例，Ⅲ級64例；淋巴結(jié)陽性80例；TNM分期Ⅰ期34例，Ⅱ期99例，Ⅲ期28例。Ki-67占比<15%者15例，≥15%者146例。

二、方法

統(tǒng)計(jì)該組織芯片中病人手術(shù)時(shí)的年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤TNM分期、病理報(bào)告中Ki-67占比等資料。對芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)染色，以檢測HIF-1α及c-myc蛋白的表達(dá)情況。若IHC陽性著色細(xì)胞數(shù)占比≤10%，則判定為陰性，>10%則判定為陽性。根據(jù)IHC結(jié)果，將病人分為HIF-1α陰性組和HIF-1α陽性組，或c-myc陰性組和c-myc陽性組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 7軟件分析數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗(yàn)和Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分析HIF-1α及c-myc蛋白的表達(dá)與TNBC病人臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。分別采用Cox單因素和多因素回歸分析找出影響其預(yù)后的影響因素和獨(dú)立危險(xiǎn)因素?；贑ox多因素分析結(jié)果分別繪制ROC曲線和列線圖，從而建立預(yù)測模型。使用R版本3.5.0生成列線圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.HIF-1α及c-myc蛋白與TNBC病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，乳腺癌組織中HIF-1α和c-myc蛋白的陽性表達(dá)率分別為45.3%(73/161)和59.0%(95/161)。χ2檢驗(yàn)和Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，HIF-1α表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)；c-myc表達(dá)與腫瘤直徑、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。在高齡病人中HIF-1α表達(dá)量更高，而在組織學(xué)Ⅲ級、淋巴結(jié)陽性、TNM分期Ⅲ期的病人中，HIF-1α和c-myc均明顯升高。這意味著，高表達(dá)的HIF-1α、c-myc與高惡性程度的TNBC密切正相關(guān)，但HIF-1α、c-myc的表達(dá)與Ki-67均未見顯著關(guān)系(P>0.05)，見表1。

表1 HIF-1α及c-myc與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.影響TNBC病人術(shù)后生存的Cox回歸分析：所有病人隨訪4～42個(gè)月，平均隨訪(24.6±7.1)個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為23個(gè)月。其中，有56例死亡，3年總生存率為65.2%(105/161)?？偵嫫跒?.8～37.2個(gè)月，平均(29.5±3.9)個(gè)月，中位總生存期為31個(gè)月。Cox單因素及多因素回歸分析中可知：組織學(xué)Ⅲ級(P=0.039)、淋巴結(jié)陽性(P=0.017)、TNM分期Ⅲ期(P=0.026)、HIF-1α及c-myc陽性(P<0.001)為三陰性乳腺癌病人術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以用來預(yù)測3年預(yù)后。其HR值依次為：HIF-1α及c-myc(HR=3.057)，淋巴結(jié)狀態(tài)(HR=2.912)，組織學(xué)分級(HR=1.785)，TNM分期III期(HR=1.631)，見表2。

表2 TNBC術(shù)后生存的Cox回歸分析

3.TNBC病人術(shù)后生存預(yù)測模型的ROC曲線:以Cox多因素回歸分析個(gè)體死亡概率對結(jié)局變量“死亡”做ROC曲線，評估該模型的預(yù)測能力。ROC曲線下面積為0.820(0.796～0.854)，說明該模型具有較高的預(yù)測價(jià)值，見圖1。

圖1 TNBC病人術(shù)后生存預(yù)測模型的ROC曲線

4.TNBC病人術(shù)后生存預(yù)測模型的列線圖:根據(jù)Cox多因素回歸分析結(jié)果，可納入組織學(xué)分級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤TNM分期、HIF-1α及c-myc表達(dá)等四個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素制作列線圖。其中HIF-1α及c-myc表達(dá)可分為四種情況：HIF-1α和c-myc均陰性、HIF-1α陰性c-myc陽性、HIF-1α陽性c-myc陰性、HIF-1α和c-myc均陽性。

根據(jù)列線圖上每一個(gè)參數(shù)對應(yīng)的評分，計(jì)算出總評分，從而預(yù)測每例TNBC病人的死亡的概率。在列線圖中，通過病人所有的變量值找到“評分”標(biāo)尺上垂直直線對應(yīng)的評分，累計(jì)所有變量值的評分，再在累計(jì)后的“總評分”標(biāo)尺上找到對應(yīng)的點(diǎn)，從而換算為“3年死亡概率”標(biāo)尺上對應(yīng)的概率，即為該病人的3年死亡概率。將每例病人臨床信息納入該列線圖進(jìn)行匹配分析，其敏感度為83.4%，特異性為76.8%，同樣證明該列線圖具有較高的預(yù)測價(jià)值，如圖2。

圖2 TNBC病人術(shù)后生存預(yù)測模型的列線圖

討 論

TNBC具有發(fā)病年輕、低分化、侵襲性高、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，預(yù)后極差，且當(dāng)前無確切的分子靶向治療手段，尋找有效的生物標(biāo)志物來篩選不良預(yù)后病人成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3-4]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，HIF-1α在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，其可參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲和新血管生成等過程[10]。作為腫瘤細(xì)胞對缺氧環(huán)境應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α可調(diào)控多種下游基因，從而增加腫瘤的侵襲能力，并且使得腫瘤對外界治療的抗性增加，可能是TNBC對放化療不敏感和高度侵襲性的原因之一[11]。張燕等[12]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和PD-L1在TNBC中共同高表達(dá)提示預(yù)后不良，提示HIF-1α可能是TNBC術(shù)后生存的危險(xiǎn)因素。

c-myc作為早期發(fā)現(xiàn)的原癌基因之一，是一種序列特異性轉(zhuǎn)錄因子[13]。和HIF-1α類似，c-myc基因在乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌和結(jié)腸癌等腫瘤中高表達(dá)，并出現(xiàn)重排現(xiàn)象。c-myc與腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、周期及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展有關(guān)[14]。Rao等[15]發(fā)現(xiàn)，在良性增生、非典型增生、乳腺癌中，c-myc的基因擴(kuò)增是逐漸遞增的，認(rèn)為c-myc在腫瘤發(fā)生的早期已被激活并且參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程。曾劍鋒等[16]報(bào)道了c-myc與TNBC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)c-myc在高級別的TNBC中高表達(dá)，認(rèn)為c-myc與TNBC病程進(jìn)展有關(guān)，但c-myc對TNBC術(shù)后生存的影響并未研究。

本研究通過免疫組化的檢測方法顯示，乳腺癌組織中HIF-1α和c-myc蛋白的陽性表達(dá)率分別為45.3%和59.0%。χ2檢驗(yàn)和Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果提示高表達(dá)的HIF-1α、c-myc與高惡性程度的TNBC密切正相關(guān)。Cox單因素和多因素回歸分析結(jié)果顯示，HIF-1α及c-myc陽性、組織學(xué)Ⅲ級、淋巴結(jié)陽性、TNM分期Ⅲ期為TNBC病人術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可以用來預(yù)測3年預(yù)后。具體而言，HIF-1α及c-myc均陽性的TNBC病人術(shù)后3年死亡風(fēng)險(xiǎn)是HIF-1α及c-myc均陰性病人的3.057倍，淋巴結(jié)陽性、組織學(xué)Ⅲ級、TNM分期Ⅲ期相對于淋巴結(jié)陰性、組織學(xué)Ⅰ～Ⅱ級和TNM分期Ⅰ～Ⅱ期術(shù)后3年死亡風(fēng)險(xiǎn)分別提高了1.912倍、0.785倍和0.631倍。以Cox多因素回歸分析個(gè)體死亡概率對結(jié)局變量“死亡”做ROC曲線，曲線下面積為0.820，具有較高的預(yù)測價(jià)值。列線圖可以根據(jù)每例TNBC病人的臨床資料，計(jì)算出術(shù)后3年死亡的大致概率，其敏感度為83.4%，特異性為76.8%，同樣證明該列線圖具有較高的預(yù)測價(jià)值。對于臨床醫(yī)生來說，一旦接診到具有上述獨(dú)立危險(xiǎn)因素的TNBC病人，需要對病人手術(shù)后的預(yù)后進(jìn)行評估，盡早為病人制定科學(xué)合理的干預(yù)方案。

本研究表明，HIF-1α和c-myc高表達(dá)以及組織學(xué)Ⅲ級、淋巴結(jié)陽性、腫瘤Ⅲ期提示TNBC病人預(yù)后不良，可以用來預(yù)測其術(shù)后生存。