程 倩, 賈戴輝, 張博慧, 許俊彥, 邵 喆, 黃應(yīng)峰, 鄒 洵

(寶船生物醫(yī)藥科技(上海)有限公司, 上海 201203)

治療性單克隆抗體(mAb)藥物是以一類γ型免疫球蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的大分子蛋白類藥物,而西妥昔單抗(cetuximab,商品名愛必妥)是最早上市的被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的抗表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)單克隆抗體,用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌的治療。默克公司生產(chǎn)的原研藥采用的細(xì)胞系為小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0),該細(xì)胞系在糖基化的表達(dá)過程中會(huì)形成N-羥乙基神經(jīng)氨酸(NGNA)與α-半乳糖(α-Gal),據(jù)文獻(xiàn)[1,2]報(bào)道,SP2/0表達(dá)的西妥昔單抗在臨床上的副作用主要是出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng),具體表現(xiàn)如呼吸困難、胸悶、皮膚瘙癢和視覺障礙等。而經(jīng)中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)的西妥昔單抗,雖具有相同的氨基酸序列,但在糖基的組成和種類上存在很大差異,主要表現(xiàn)為形成N-乙基神經(jīng)氨酸(NANA)的唾液酸化糖型修飾,且不再含有α-Gal,大大降低了潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。

截至目前,已上市的單克隆抗體藥物絕大多數(shù)都是含有2個(gè)糖基化位點(diǎn),且對(duì)稱分布于兩條重鏈上[6-8]。而已上市的西妥昔單抗是唯一一個(gè)具有4個(gè)糖基化位點(diǎn)的單抗藥物,其中抗原結(jié)合片段(Fab)的2個(gè)糖基化位點(diǎn)位于高可變區(qū)(VH),可結(jié)晶片段(Fc)的2個(gè)糖基化位點(diǎn)位于恒定區(qū)2(CH2)。西妥昔單抗由SP2/0細(xì)胞表達(dá),糖基化更加復(fù)雜,并伴隨大量的唾液酸化,導(dǎo)致其具有顯著的電荷異質(zhì)性[9,10]。目前國內(nèi)外許多研究者開始開發(fā)以CHO細(xì)胞表達(dá)的西妥昔單抗,相比于SP2/0細(xì)胞表達(dá),在Fab和Fc段的糖基化修飾上會(huì)有比較大的差異,特別是Fab段,不再含有a-Gal和NGNA,取而代之的是大量的NANA。這種聚糖種類的變換以及聚糖含量不同的差異,對(duì)生物學(xué)活性及功能的影響,甚至在臨床上的表現(xiàn),還在進(jìn)一步研究當(dāng)中[11-14]。

本文以CHO細(xì)胞表達(dá)的西妥昔單抗為研究對(duì)象(CHO-cetuximab),從糖蛋白水平和聚糖水平對(duì)其糖基化修飾做了系列研究。主要利用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo F2),結(jié)合質(zhì)譜對(duì)質(zhì)量數(shù)的歸屬分析,考察了抗體原液經(jīng)Endo F2不同時(shí)間處理后的聚糖釋放效果。結(jié)果顯示,Endo F2對(duì)抗體Fab段的糖基化位點(diǎn)具有很高的酶切效率,能快速切除Fab段的聚糖,而Fc段的聚糖不受影響。對(duì)經(jīng)Endo F2酶切下來的聚糖,進(jìn)一步通過對(duì)氨基苯甲酰胺(2-AB)標(biāo)記后使用親水相互作用色譜柱(HILIC)分離,在超高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(UPLC-FLR)上實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確的聚糖比例分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

CHO-西妥昔單抗為本公司經(jīng)CHO穩(wěn)定細(xì)胞系表達(dá)的西妥昔單克隆抗體原液。高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive、蛋白質(zhì)分析軟件Biopharma Finder 3.2和液相系統(tǒng)Dionex U3000均購自Thermo Scientific公司(美國);超高效液相色譜Acquity UPLC H-Class plus系統(tǒng)、熒光檢測(cè)器2475 FLR均購自Waters公司(美國);糖苷酶Endo F2購自Agilent公司(美國);N-肽糖苷酶F(PNGase F)購自NEB公司(英國);乙腈(ACN)、2-AB(純度≥98%)購自Sigma-Aldrich公司(美國);甲酸胺購自Honey Well公司(美國);超純水Milli-Q系統(tǒng)購自Millipore公司(美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1釋放抗體Fab和Fc聚糖

Endo F2酶切[15]:將抗體原液用超純水稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加入Endo F 21.0 μL,快速混勻后于37 ℃下孵育16 h。取50 μL用于LC-MS分析,剩余50 μL加入150 μL預(yù)冷的冰乙醇,于-20 ℃條件下沉淀蛋白質(zhì),以13 000 r/min離心5 min后取上清液用于聚糖的定性分析。

PNGase F酶切[15,16]:將抗體原液用8 mol/L鹽酸胍變性稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加入PNGase F 2.0 μL,快速混勻后于37 ℃下孵育16 h。其余操作同Endo F2酶切。

1.2.2Fab聚糖的快速釋放以及熒光標(biāo)記

將抗體原液用超純水稀釋至1.0 mg/mL,然后取100 μL,加1.0 μL Endo F2酶,快速混勻后于37 ℃下孵育5 min。取50 μL用于LC-MS分析,剩余50 μL加入150 μL預(yù)冷的冰乙醇,于-20 ℃放置40 min,沉淀蛋白質(zhì),以13 000 r/min離心5min后取上清液,經(jīng)真空濃縮干燥儀徹底干燥,加入2-AB標(biāo)記液于65 ℃避光標(biāo)記3 h(使聚糖具有熒光信號(hào)),用50 μL 70%乙腈水溶液復(fù)溶,然后進(jìn)行UPLC-FLR聚糖比例的分析[15]。

1.2.3LC-MS分析

采用Waters BioResolve RP mAb多苯色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),流動(dòng)相A和B分別為0.1%(v/v)FA水溶液和含0.1%(v/v)FA的乙腈溶液,流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)?～2 min, 10%B; 2～6 min, 10%B～90%B。

質(zhì)譜采用正離子模式,噴霧電壓設(shè)為3.8 kV,毛細(xì)管加熱溫度320 ℃,輔助氣溫度350 ℃,鞘氣壓力40 arb,輔助氣壓力10 arb,一級(jí)質(zhì)譜掃描質(zhì)荷比(m/z)范圍1 800～5 000。采用BioPharma Finder 3.2軟件對(duì)原始譜圖進(jìn)行去卷積化處理,m/z處理范圍:2 000～4 000;輸出質(zhì)量數(shù)范圍:130 000～160 000。

1.2.4UPLC-FLR分析

采用Waters BEH Amide親水色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流動(dòng)相A為100 mmol/L甲酸銨溶液(pH 4.5),流動(dòng)相B為乙腈,流速0.5 mL/min,柱溫60 ℃。梯度洗脫程序?yàn)?～18 min, 2%A～22%A; 18～38 min, 22%A～44%A。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)330 nm,接收波長(zhǎng)420 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體Fab與Fc聚糖的釋放與分析

糖苷酶PNGase F是抗體糖基化研究過程中一種常用的聚糖釋放酶,能快速并完全釋放聚糖并進(jìn)行相應(yīng)的定量研究,特異性地切斷糖基化位點(diǎn)天冬酰胺(Asn)和與之相連N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵,并將Asn轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼?Asp)[17,18]。Endo F2也能實(shí)現(xiàn)聚糖的釋放,能切斷兩個(gè)N-乙酰葡糖胺之間β-1,4鍵,釋放截短的聚糖分子,同時(shí)另一個(gè)N-乙酰葡糖胺仍保留在糖基化位點(diǎn)的Asn上[19,20]。

CHO-西妥昔單抗蛋白分子為IgG1型,且共有4個(gè)糖基化位點(diǎn),每條重鏈的Fab段和Fc段各有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn),可以通過糖苷酶PNGase F和Endo F2對(duì)其切糖,釋放出相應(yīng)的聚糖后進(jìn)行糖相關(guān)分析(見圖1)。

圖 1 西妥昔單抗結(jié)構(gòu)及釋放的聚糖Fig. 1 Structure of cetuximab and glycans released from antibody CHO: Chinese hamster ovary.

將變性后的抗體經(jīng)PNGase F酶切16 h后,使用LC-MS檢測(cè),經(jīng)去卷積處理后(見圖2a),測(cè)得酶切后抗體分子的質(zhì)量數(shù)為145 277.66(理論相對(duì)分子質(zhì)量為145 277.67 Da),說明抗體的聚糖已經(jīng)被完全切除,同時(shí)糖基化位點(diǎn)的Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。而未變性的抗體經(jīng)Endo F2酶切16 h后(見圖2b),測(cè)得酶切后抗體分子的質(zhì)量數(shù)為146 672.05(理論相對(duì)分子質(zhì)量為146 670.28 Da),說明抗體的聚糖也已經(jīng)被完全切除,同時(shí)糖基化位點(diǎn)上均保留了GnF。以上結(jié)果表明，在相同的酶切時(shí)間16 h的條件下,Endo F2與PNGase F的變性酶切均能實(shí)現(xiàn)聚糖的完全釋放。將釋放出來的聚糖,在HILIC柱上分離并與質(zhì)譜進(jìn)行聯(lián)用分析,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體全部聚糖的鑒定,可以看到CHO-西妥昔單抗上有較多的唾液酸化糖型G2FS1和G2FS2,此外兩種酶切方式產(chǎn)生的糖譜非常相似(見圖3),說明對(duì)聚糖的定性和定量具有一致性的結(jié)果。

在以往對(duì)西妥昔單抗的糖基化研究中發(fā)現(xiàn),PNGase F在非變性條件下能切除Fc段Asn 299位置的糖基,但Fab段的Asn 88位置的糖基依然存在,而Endo F2能在非變性條件下切除Fab段的糖基[18]。這種選擇性的切除方式推測(cè)是與抗體的空間結(jié)構(gòu)有關(guān),糖苷酶在進(jìn)攻糖基化位點(diǎn)時(shí)需要突破空間位阻才能進(jìn)行切糖。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),使用Endo F2在非變性條件下處理CHO-西妥昔單抗,只要酶切時(shí)間足夠長(zhǎng),Endo F2既能完全切除Fab段的糖基,也能完全切除Fc段的糖基。我們推測(cè)抗體的空間位阻效應(yīng)降低了Endo F2對(duì)Fc段糖的酶切效率,但無法阻止其對(duì)Fc段糖的酶切,因此我們后續(xù)考察了Endo F2的不同酶切時(shí)間。

圖 2 糖苷酶處理16 h后的TIC色譜圖和去卷積譜圖Fig. 2 TIC chromatograms and deconvoluted mass spectra after glycosylation 16 h a. PNGase F; b. Endo F2.

圖 3 聚糖的TIC色譜圖Fig. 3 TIC chromatograms of glycans a. PNGase F; b. Endo F2.

2.2 Endo F2酶切時(shí)間的考察

經(jīng)Endo F2酶切5 min(見圖4a),可以看到只有Ⅰ類質(zhì)量數(shù),通過對(duì)比理論分子量對(duì)照表(見附表S1,詳見http://www.chrom-China.com),確定為抗體的Fab段2個(gè)位點(diǎn)均被切除:Fab段聚糖被切除后均保留了巖藻糖化的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)殘基(GnF), Fc段上2個(gè)位點(diǎn)保留了G0F、G1F、G2F之間的聚糖組合。說明Endo F2對(duì)Fab段的酶切效率非常高,5 min就已經(jīng)將抗體Fab段2個(gè)位點(diǎn)上的聚糖完全切除,而Fc段的聚糖未受影響。酶切30 min后可以看到除了有Ⅰ類的質(zhì)量數(shù),還有Ⅱ類的質(zhì)量數(shù)(見圖4b), Ⅱ類質(zhì)量數(shù)確定為抗體的Fab段2個(gè)位點(diǎn)均被切除和Fc段1個(gè)位點(diǎn)被切除:Fab段的2個(gè)位點(diǎn)和Fc段的1個(gè)位點(diǎn)被切除后均保留了GnF,而Fc段還有1個(gè)位點(diǎn)保留了G1-GN、G0F、G1F、G2F。說明酶切時(shí)間至30 min時(shí),有一部分抗體的Fc段中1個(gè)位點(diǎn)上的聚糖開始被切除了。進(jìn)一步延長(zhǎng)酶切時(shí)間至300 min后(見圖4c),可以看到有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類質(zhì)量數(shù),Ⅲ類質(zhì)量數(shù)確定為抗體的Fab段2個(gè)位點(diǎn)和Fc段2個(gè)位點(diǎn)均被切除:4個(gè)位點(diǎn)上均保留了GnF,相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量數(shù)為146 670.08。得出Endo F2對(duì)Fc段的酶切效率相對(duì)較低,酶切300 min后仍然有較多Fc聚糖未完全切除的抗體,若要完全切除Fc段的聚糖則需要更長(zhǎng)的時(shí)間,如本實(shí)驗(yàn)中的16 h。

抗體藥物的生產(chǎn)工藝非常復(fù)雜,而且批次間的質(zhì)量屬性可能會(huì)有一些波動(dòng),尤其是糖型方面,對(duì)西妥昔單抗這種具有復(fù)雜糖基化位點(diǎn)的藥物,分析各個(gè)位點(diǎn)上的糖基化顯得尤為重要。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看,使用Endo F2酶切5 min,抗體的Fab段2個(gè)位點(diǎn)的聚糖完全被切除,說明該條件下可以專一性地切除Fab段位點(diǎn)上的聚糖,本實(shí)驗(yàn)也因此未做更短酶切時(shí)間的考察?？贵w經(jīng)Endo F2酶切后,后續(xù)可以通過UPLC-FLR準(zhǔn)確分析Fab段位點(diǎn)上的聚糖比例,對(duì)抗體生產(chǎn)工藝的評(píng)估具有非常重要的意義。

圖 4 Endo F2不同酶切時(shí)間的質(zhì)譜圖Fig. 4 Mass spectra of Endo F2 for different digestion times a. 5 min; b. 30 min; c. 300 min.

圖 5 來自不同生產(chǎn)工藝的CHO-西妥昔單抗抗體Fab段的糖譜Fig. 5 Glycan profiles of CHO-cetuximab antibody Fab segments from different production processes G2(F)S1 terminal sialic acid has two linkages, labeled as G2(F)S(2,3)1 and G2(F)S(2,6)1. G2(F)S2 terminal sialic acid also has two linkages, labeled as G2(F)S(2,3)2 and G2(F)S(2,6)2.

2.3 UPLC-FLR對(duì)Fab段聚糖的比例分析

從糖蛋白上釋放的聚糖經(jīng)2-AB衍生化后,使用HILIC色譜柱在UPLC-FLR上可以實(shí)現(xiàn)聚糖的比例分析。CHO-西妥昔單抗抗體經(jīng)Endo F2酶切5 min,釋放的聚糖經(jīng)2-AB標(biāo)記后,在HILIC色譜柱上具有良好的分離效果(見圖5),結(jié)果展示了Fab段的糖基化修飾結(jié)果,圖5a和圖5b的樣品產(chǎn)自兩個(gè)不同的生產(chǎn)工藝,分別是工藝Ⅰ和工藝Ⅱ,其中工藝Ⅱ是在工藝Ⅰ基礎(chǔ)上,在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中額外加入了適量的糖型調(diào)節(jié)劑,從而調(diào)節(jié)了抗體的糖型。從結(jié)果可以看出,經(jīng)不同生產(chǎn)工藝表達(dá)的CHO-西妥昔單抗在Fab段的糖譜上具有非常明顯的差異。其中還可以看出含唾液酸化的聚糖比例也相差較大,工藝Ⅰ的G2(F)S1和G2(F)S2的總比例較低,約25.0%,而工藝Ⅱ的總比例較高,約41.4%。此外,為了考察本方法的穩(wěn)定可靠性,我們獨(dú)立做了3次試驗(yàn),工藝Ⅱ樣品的3次Endo F2酶切后的相對(duì)分子質(zhì)量基本一致(見附圖S1), RSD值幾乎為0, 3次試驗(yàn)的聚糖在HILIC色譜柱上的比例分析譜圖也基本一致(見附圖S2),峰面積的RSD值均小于5.0%,表明本方法具有較好的穩(wěn)定性。

抗體的Fab區(qū)是識(shí)別抗原的關(guān)鍵區(qū)域,西妥昔單抗Fab上的糖基化位點(diǎn)處在抗體重鏈的可變區(qū),該位點(diǎn)上的糖基化可能參與免疫調(diào)節(jié),影響抗原抗體的親和力,因此對(duì)該位點(diǎn)的糖基化修飾分析具有非常重要的意義。通過Endo F2非變性酶切5 min,結(jié)合2-AB標(biāo)記的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Fab段聚糖的糖型比例分析,對(duì)指導(dǎo)抗體生產(chǎn)工藝的優(yōu)化起到非常大的幫助。

3 結(jié)論

本文針對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)的西妥昔單抗,開發(fā)了Endo F2快速酶切結(jié)合UPLC-FLR檢測(cè)的糖型分析方法,不僅對(duì)Fab段糖基化修飾的分析具有很好的專一性,而且還具有較好的穩(wěn)定可靠性,大大提高了檢測(cè)效率。這對(duì)研發(fā)者研究具體的糖型構(gòu)成,抗體抗原的親和力等提供了數(shù)據(jù)支撐,對(duì)經(jīng)不同細(xì)胞表達(dá)的，以及經(jīng)不同的細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的西妥昔單抗,研究Fab段糖型的變化和電荷異質(zhì)性提供了一種非常方便、快捷、準(zhǔn)確的分析手段,并能夠有效指導(dǎo)生產(chǎn)工藝的優(yōu)化以及后續(xù)工藝可比性的研究。