胡琴 張晨曦 柯少瑞

河南中醫(yī)藥大學1呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，2河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點實驗室，3中醫(yī)藥科學院，4藥學院（鄭州450046）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是以肺實質(zhì)纖維化和肺功能喪失為特征進行的最終致死性疾?。?］。歐美數(shù)據(jù)顯示，70 歲以上老年人患IPF 風險是40 歲以上人群的6.9 倍［2-3］，在2000年至2008年，IPF 的發(fā)病率增加了35%，累計患病率從13.4/10 萬上升到18.2/10 萬［4-5］。肺泡上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是IPF 發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一［6-7］。臨床研究證實IPF 患者肺組織內(nèi)存在肺泡上皮細胞EMT 異常活躍的現(xiàn)象，肺上皮細胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)化為成纖維細胞和肌成纖維細胞，促進病程發(fā)展［8］。目前，IPF 的治療原則主要集中在抗纖維化、抗炎、抗氧化等方面，主要治療藥物有吡非尼酮、尼達尼布、糖皮質(zhì)激素、N-乙酰半胱氨酸等［9］，但均存在較多副作用。因此，亟需加強IPF 分子病理機制研究，為其有效防治提供實驗基礎。研究表明，自噬與IPF 的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［10-11］。LI 等［12］實驗表明，瑞格非尼通過TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導促進肌成纖維細胞自噬，抑制肌成纖維細胞的活化和EMT 的產(chǎn)生，從而緩解肺纖維化。TENG 等［13］在TGF-β1 刺激的肝星形細胞中熊去氧膽酸通過下調(diào)線粒體自噬的表達抑制肝纖維化。由此可推測細胞自噬與EMT在IPF 進程及治療中具有重要作用。因此，本實驗利用TGF-β1 誘導人源肺泡上皮細胞A549 建立纖維化模型，觀察肺上皮細胞EMT 及自噬水平的改變，并通過使用雷帕霉素（rapamycin，RAPA）促進自噬，觀察其對A549 細胞EMT 的影響，探討自噬對A549 細胞EMT 的調(diào)節(jié)作用及其機制，為進一步闡明IPF 的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人源肺泡上皮細胞A549，購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA 消化液、PBS 緩沖液（Biological Industries 公司，南美）；自噬激動劑RAPA（MedChemExpress 公司，美國）；RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；PAGE 凝膠制備試劑盒、彩色預染蛋白Marker（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）；GAPDH、Beclin1、E-cadherin（E-cad）、N-cadherin（N-cad）、Fibronectin（FN1）抗體，山羊抗鼠、抗兔二抗，免疫熒光二抗（武漢Proteintech 公司）；LC3 抗體（GeneTex 公司，美國）；p62 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；4%多聚甲醛、QuickBlock免疫染色封閉液、免疫染色通透液（Triton X-100）等試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 建立TGF-β1 誘導的A549 細胞模型A549細胞用含10%胎牛血清和1% 青/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度達30%左右，更換為無血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)2 h，分別以2.5、5、7.5、10、15 ng/mL 的TGF-β1 刺激細胞，培養(yǎng)48 h 后觀察細胞形態(tài)，利用CCK8 檢測24、48 h細胞活力，Western blot 檢測EMT 相關(guān)蛋白E-cad、N-cad 及自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62 的表達，篩選出細胞形態(tài)較好、無細胞毒性、蛋白表達變化明顯的誘導濃度及時間，最終以5 ng/mL TGF-β1刺激A549細胞48 h建立肺纖維化體外模型。模型建立后，選用10 nmol/L RAPA觀察自噬對A549細胞EMT的影響，將A549 分為空白組（control）、模型組（5 ng/mL TGF-β1）、RAPA組（10 nmol/L）、TGF-β1+RAPA（5 ng/mL TGF-β1+10 nmol/L RAPA）組，培養(yǎng)48 h 后，進行檢測。

1.3 細胞活力檢測A549 細胞接種于96 孔板中，每組設立6 個復孔，孵育24 h，給予不同濃度TGFβ1 分別處理24、48 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，在450 nm 處檢測各組吸光值，計算各組細胞的相對活力。細胞活力（%）=實驗組吸光值/對照組吸光值×100%。

1.4 TEM 的檢測細胞收集后置于2.5%的戊二醛中固定24 h 后，用PBS 洗滌3 次。細胞沉淀在25 ℃下用1%鋨酸進行后固定2 h，再次用PBS 洗滌三次，然后在0%、50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇溶液中脫水，每個梯度處理15 min，再用100%丙酮脫水處理2 次。用100%環(huán)氧樹脂浸潤細胞沉淀10 min，重復3 次，再用1∶1（Epon812：丙酮）緩慢搖晃滲透2 h 以上，Epon812 中浸潤24 h 以上。將樣品轉(zhuǎn)移至包埋槽之中，加入適量的Epon812，置于60 ℃的烘箱中處理48 h 以上。超薄切片機將樣品切成超薄切片（40 ～70 nm），用1%乙酸雙氧鈾和0.1%檸檬酸鉛染色各30 min，并在透射電鏡下（Tecnai G220 S-Twin 美國）觀察并拍照。

1.5 Western blot收集不同處理組細胞后，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度，使各組蛋白濃度一致，蛋白變性后每孔加入20 μg 蛋白樣品，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，隨后進行封閉，TBST 洗滌3 次。加入稀釋好的一抗，GAPDH 抗體（1∶5 000）、Beclin1 抗體（1∶5 000）、p62 抗體（1∶1 000）、E-cad 抗體（1∶5 000）、N-cad 抗體（1∶5 000），置于4 ℃過夜。次日棄一抗，TBST 洗3 次；加入二抗，室溫孵育1 h，棄二抗，TBST 洗3 次，滴加ECL 發(fā)光液，使用超高靈敏化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并保存結(jié)果圖片，進行后續(xù)分析。

1.6 免疫熒光檢測A549 接種于24 孔板細胞爬片中，RAPA 預處理2 h，TGF-β1 刺激48 h 后用PBS洗滌2 次，4%多聚甲醛固定20 min 后，PBS 洗滌2 次。每孔滴加500 μL 通透液（Triton X-100），室溫通透10 min 后，PBS 洗滌2 次。每孔加入500 μL免疫染色封閉液，室溫封閉2 h 后，PBS 洗滌3 次。加入兔抗LC3 和鼠抗FN1 抗體（1∶500），混勻之后加入孔中，4 ℃過夜后，PBS 洗滌4 次，5 min/次。加入免疫熒光二抗（1∶300），室溫孵育1 h，PBS 洗滌4 次，5 min/次。滴加適量抗熒光淬滅封片液（含DAPI）至載玻片上，取出細胞爬片倒扣于載玻片，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細胞并拍照。

1.7 統(tǒng)計學方法采用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示兩組間差異比較采用t檢驗；多組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 對A549 細胞形態(tài)及活力的影響利用不同濃度的TGF-β1（0、2.5、5、7.5、10、15 ng/mL）分別作用于A549 細胞。誘導48 h 后，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，見圖1A-F，對照組細胞形態(tài)無明顯變化，呈不規(guī)則多邊形；與對照組相比，實驗組細胞形態(tài)由不規(guī)則多邊形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，形態(tài)發(fā)生顯著性變化。CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，在實驗濃度范圍內(nèi)，TGF-β1誘導24、48 h后對A549細胞無明顯的細胞毒性作用（P＞0.05，圖1 G、H）。

圖1 不同濃度TGF-β1 對A549 細胞形態(tài)及活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TGF-β1 on morphology and viability of A549 cells

2.2 TGF-β1 對自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達的影響檢測經(jīng)TGF-β1 誘導A549 細胞48 h 后EMT 標志物E-cad 和N-cad，自噬標志物Beclin1 和p62的相對蛋白表達水平。見圖2，與對照組相比，經(jīng)TGF-β1 濃度梯度誘導后，Beclin1、E-cad 的蛋白表達下調(diào)，p62、N-cad 的蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）。最終選擇5 ng/mL TGF-β1 誘導A549 細胞48 h 作為最佳作用濃度和時間，進行后續(xù)實驗研究。

圖2 不同濃度TGF-β1 對自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達的影響Fig.2 Effects of different concentrations of TGF-β1 on autophagy and EMT-related protein expression

2.3 TGF-β1 對A549 細胞自噬的影響TEM 觀測5 ng/mL TGF-β1 誘導A549 細胞48 h 后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，見圖3，和對照組相比，TGF-β1 誘導后細胞形態(tài)向梭形轉(zhuǎn)變，發(fā)生顯著變化；對照組中細胞內(nèi)可以觀察到自噬溶酶體，而TGF-β1 誘導后自噬溶酶體數(shù)量顯著減少。

圖3 TEM 觀察TGF-β1 對A549 細胞自噬的影響Fig.3 TEM observation of the effect of TGF-β1 on autophagy of A549 cells

2.4 自噬激動劑對自噬和EMT 蛋白表達的影響通過Western blot 檢測加入自噬激動劑RAPA后自噬指標（Beclin1、p62）和EMT相關(guān)指標的變化。見圖4，與對照組相比，模型組中Beclin1、E-cad表達下調(diào)，p62、N-cad 表達上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，RAPA+TGF-β1 組中，Beclin1、E-cad 表達上調(diào)，p62、N-cad 表達下調(diào)（P＜0.05）。

圖4 自噬激動劑對自噬和EMT 相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effects of autophagy agonists on the expression of autophagy and EMT-related proteins

2.5 免疫熒光檢測自噬激動劑對LC3 和FN1 表達的影響通過免疫熒光的方法檢測各組細胞的LC3、Fibronectin 蛋白的表達水平，見圖5，與對照組相比，TGF-β1 組LC3 的表達水平明顯降低，而FN1 的表達明顯升高；加入自噬激動劑后，與TGFβ1 相比，LC3 表達水平明顯上升，同時FN1 表達水平明顯降低。

圖5 免疫熒光檢測自噬激動劑對LC3 和FN1 表達的影響（400×）Fig.5 Immunofluorescence detection of the effect of autophagy agonists on the expression of LC3 and FN1（400×）

3 討論

TGF-β1 是一種重要的促纖維化細胞因子，是器官纖維化的重要調(diào)控因子，可通過介導EMT、成纖維細胞活化、膠原沉積等過程加重肺纖維化［14］。本研究采用TGF-β1 對A549 細胞進行誘導，誘導后與對照組相比，實驗組細胞形態(tài)由不規(guī)則多邊形向梭形轉(zhuǎn)變，細胞分散開來，呈現(xiàn)出EMT的典型表象。Western blot 結(jié)果也證實，模型組出現(xiàn)了上皮標志物蛋白E-cad 下調(diào)，間質(zhì)標志物蛋白N-cad 上調(diào)，說明TGF-β1 誘導的A549 細胞的EMT模型是可行的、成功的而且相對穩(wěn)定。

EMT 是上皮細胞失去細胞-細胞黏附和頂端-基底極性的生物學過程，從而獲得遷移、侵襲和產(chǎn)生ECM 成分的間質(zhì)特征，導致底層基膜的降解［15］。臨床病理學研究發(fā)現(xiàn)，IPF 患者肺上皮細胞發(fā)生EMT 轉(zhuǎn)化為成纖維細胞和肌成纖維細胞，促進病程的發(fā)展，EMT 已成為IPF 發(fā)病的重要機制之一。在特發(fā)性肺纖維化的人體組織樣本中，EMT主要信號通路標記物在成纖維細胞病灶和受損的上皮細胞中同時表達，為EMT 在人類病理學中發(fā)揮作用提供了間接證據(jù)［16-17］。研究證實，在IPF中，肺泡上皮細胞EMT 的發(fā)生涉及缺氧、蛋白磷酸化、細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)失衡等多種因素。最近研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬可能是調(diào)控肺泡EMT 有效改善肺纖維化的另一條重要途徑，而關(guān)于細胞自噬和肺纖維化的分子機制研究卻鮮有報道。

細胞自噬是細胞對營養(yǎng)缺乏、生長因子剝奪、感染和缺氧等不同形式下應激所做出的適應性過程。自噬活性變化能夠影響神經(jīng)退行性病變、腫瘤和傳染性疾病等多種疾病的病理過程。SHI 等［18］發(fā)現(xiàn)IPF 患者miR199a-5p 通過靶向Sirt1/AMPK 信號通路調(diào)控自噬且通過調(diào)節(jié)自噬可誘導IPF 患者間充質(zhì)干細胞衰老；同時證實抑制miR199a-5p 可恢復間充質(zhì)干細胞活力，延緩小鼠肺纖維化進程。此外，BAEK 等［19］發(fā)現(xiàn)亞精胺通過激活IPF 成纖維細胞和博來霉素誘導的纖維化肺組織中關(guān)鍵的自噬分子LC3-Ⅱ、Beclin-1 和ATG7 的表達來促進自噬小體的形成，有助于緩解肺部纖維化。LC3 含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正相關(guān)，與自噬程度呈正相關(guān)［20］。p62 是一種自噬降解底物蛋白，當內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ蛋白則被解離為LC3-Ⅰ并回到細胞質(zhì)再次被利用，p62 蛋白則被降解，其表達水平往往與自噬水平負相關(guān)［21］。Beclin1 是在自噬過程中與形成吞噬小體的起始有關(guān)，對自噬至關(guān)重要［22］。Western blot和免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導的A549 細胞EMT 的過程中，Beclin1 和LC3 蛋白表達下調(diào)，而p62 蛋白表達顯著性增加，表明細胞自噬水平顯著降低；TEM 結(jié)果也證實，TGF-β1誘導的A549 細胞的自噬水平下降。因此，進一步深入研究細胞自噬在肺上皮細胞EMT 中的作用將有助于探索調(diào)控EMT 過程的新的分子生物學機制，為早期干預IPF 的形成提供靶點。

自噬激動劑RAPA 在體內(nèi)與重組人FKBP12蛋白相結(jié)合產(chǎn)生復合物，該復合物能夠與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相結(jié)合，并抑制mTOR 的活化，達到增強自噬的作用［23］。本研究選用RAPA 促進細胞自噬，以觀察自噬對EMT 的影響。Western blot 與免疫熒光結(jié)果均顯示，與模型組相比，RAPA+TGF-β1 組提高了細胞的自噬水平，激活細胞自噬能顯著改善TGF-β1 誘導的EMT 現(xiàn)象，進而緩解肺泡上皮細胞纖維化的發(fā)生。

綜上所述，肺泡上皮細胞A549 在TGF-β1 誘導下發(fā)生EMT，同時細胞自噬水平下降；利用RAPA提高細胞自噬水平可以抑制EMT 過程，表明提高細胞自噬水平可能對TGF-β1 誘導的EMT 具有抑制作用，這為未來從自噬角度研發(fā)IPF 的防治藥物提供了理論依據(jù)。然而，細胞自噬在TGF-β1 誘導的A549 纖維化模型中的過程中發(fā)揮的具體作用及分子機制還有待進一步闡明，故需更多的細胞、動物和臨床實驗研究進一步探索自噬與IPF 的作用關(guān)系。