孫萌，劉偉，劉海霞，于波

冠狀動脈粥樣硬化的臨床診斷一直備受關(guān)注。目前冠狀動脈造影是其診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]，但操作有創(chuàng)傷性、成本高，并伴有副作用的產(chǎn)生，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用規(guī)?！，F(xiàn)有的一些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物（如超敏C 反應(yīng)蛋白等）又不能很好地判定疾病的發(fā)生，時常導(dǎo)致漏診或誤診。因此，迫切需要一種能夠發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)志物的方法，為疾病的早期診斷提供更有價值的參考指標(biāo)。

代謝組學(xué)的研究對象是處于代謝途徑末端的內(nèi)源性小分子化合物，可以更直接、準(zhǔn)確地反映機體狀態(tài)，故代謝組學(xué)為發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物提供了新方法。目前代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心血管疾病的臨床診斷與發(fā)病機制研究[2-5]，但對于早期冠狀動脈粥樣硬化患者血漿中生物標(biāo)志物的研究卻鮮有報道。呂曉鵬等[6]、張冬偉等[7]利用代謝組學(xué)技術(shù)探討早期動脈粥樣硬化患者的血液生物標(biāo)志物。然而，這些研究均以健康志愿者作為對照者，對照組缺乏血管狹窄程度的客觀證據(jù)，并且試驗樣本量均較小，使得篩選出的生物標(biāo)志物存在假陽性或非特異性的可能。

本研究采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）聯(lián)用的代謝組學(xué)方法分析早期冠狀動脈粥樣硬化患者和對照者血漿代謝物差異，結(jié)合模式識別方法，尋找與早期冠狀動脈粥樣硬化病變密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 對象及分組

選取2012 年8 月至2014 年7 月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院并行冠狀動脈造影術(shù)且定量分析（QCA）測定狹窄度<50%的患者。排除心肌梗死患者；曾做過經(jīng)皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈旁路移植術(shù)的患者；合并重度心力衰竭伴超聲心動圖左心室射血分?jǐn)?shù)<30%的患者；明確診斷有糖尿病、甲狀腺功能亢進等代謝性疾病的患者；伴有嚴(yán)重肝腎功能不全的患者；患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重感染性疾病或多器官功能衰竭的患者；妊娠期或哺乳期女性。進一步根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果將符合上述要求的120例研究對象分為：對照組（冠狀動脈造影未發(fā)現(xiàn)任何可辨認(rèn)的斑塊或狹窄）60 例和早期冠狀動脈粥樣硬化組（QCA 測定冠狀動脈狹窄<50%）60 例。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有血液樣本的采集和臨床資料的收集均獲得受試者本人知情同意。

1.2 樣品采集與制備

所有研究對象于入院后第2 日清晨空腹采集肘靜脈血3 ml，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管中，以3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液（血漿）分裝后，立即放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

進樣前，將血漿樣品從-80 ℃冰箱中取出，于4 ℃條件下解凍。取100 μl 置于2 ml 離心管中，加入500 μl 乙腈溶液，充分渦旋2 min 后，于4 ℃下以14 000 r/min 離心15 min，取上清液于真空離心濃縮儀中抽干。殘留物以100 μl 75%乙腈溶液復(fù)溶，渦旋混勻1 min 后，于4℃，14 000 r/min 離心15 min，吸取上清液至進樣瓶中待測。

1.3 液相色譜分離條件

血漿樣本中代謝物的分離是在1260 型液相色譜儀（Agilent 公司，美國）上采用二元溶劑梯度洗脫方式完成。色譜柱為ZORBAX SB-C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；流動相A 為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下：0～18.0 min，5%～98%流動相B；18.0～21.0 min，98%流 動 相B；21.0～21.1 min，98%～5%流 動 相B；21.1～28.0 min，5%流動相B；流動相流速為0.5 ml/min；柱溫維持在40℃；進樣量為10 μl。

1.4 QTOF/MS 質(zhì)譜分析條件

樣品經(jīng)LC 分離后不分流直接注入Agilent 6530四級桿飛行時間質(zhì)譜儀中，分別在電噴霧離子源的正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）下進行代謝輪廓分析。相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流量為10 L/min；碎裂電壓為110 V；毛細管電壓分別為+4 000 V/-3 500 V；以一級質(zhì)譜全掃描（MS）模式對質(zhì)荷比（m/z）范圍50～1 000 內(nèi)的所有數(shù)據(jù)進行采集，掃描頻率為0.5 s。為了對代謝物進行鑒定，采用二級質(zhì)譜（MS/MS）掃描方式獲得質(zhì)譜碎片信息，高純氮氣作為碰撞氣體，碰撞能量分別設(shè)為10 V、20 V、40 V。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將檢測得到的原始數(shù)據(jù)通過Agilent 自帶的MassHunter Qualitative Analysis 軟件轉(zhuǎn)換為mzdata 格式，然后導(dǎo)入到R 語言XCMS 程序包中進行保留時間校正、峰識別、峰匹配、峰對齊和濾噪等過程，其中相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：method=“centWave”，peakwidth=c（10，50），其余參數(shù)采用默認(rèn)值，最終得到一個包含質(zhì)荷比、保留時間與峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。進一步對所得數(shù)據(jù)進行歸一化處理，即將每個離子的峰強度除以該樣品中所有離子峰強度之和。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析與差異代謝物的篩選

將上述歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5 軟件中進行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA），獲得變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，用于尋找與疾病相關(guān)的差異代謝物。進一步采用SPSS 22.0 軟件進行單變量統(tǒng)計分析（Kruskal-Wallis 檢驗），得到組間有差異的代謝物（P<0.05）。將同時滿足VIP>1 和P<0.05 的變量篩選為最終的差異代謝物。為了排除PLS-DA 模型存在過擬合的危險，本研究采用隨機置換檢驗（經(jīng)100 次置換）考察建立模型的有效性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本情況比較（表1）

表1 兩組患者的基本情況（±s）

表1 兩組患者的基本情況（±s）

注：-：無

早期冠狀動脈粥樣硬化組的男性為37 例，女性為23 例，平均年齡為（58.43 ± 9.69）歲；而對照組的男性為29例，女性為31例，平均年齡則為（55.88 ± 9.50）歲。經(jīng)比較分析可得，兩組患者在年齡、性別上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，除了載脂蛋白A在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義外，其它各項指標(biāo)在組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。由于選擇試驗對象的條件限制，所有早期冠狀動脈粥樣硬化組患者為冠狀動脈造影顯示至少一支主支冠狀動脈管腔直徑狹窄<50%者，其平均狹窄程度為（36.53 ± 12.82）%，而對照組全部患者為經(jīng)冠狀動脈造影確認(rèn)冠狀動脈管腔未發(fā)現(xiàn)任何可辨認(rèn)斑塊或狹窄者。

2.2 血漿樣品代謝輪廓分析

通過LC-QTOF/MS 平臺獲得早期冠狀動脈粥樣硬化組及對照組的血漿樣品總離子流色譜圖，如圖1 所示。早期冠狀動脈粥樣硬化組和對照組的總離子流圖中的譜峰大體上是一致的，無法直接從譜圖上觀察出兩組的差異，說明兩組間可能存在復(fù)雜、微弱的變化，因此需要采用統(tǒng)計分析和模式識別方法進一步挖掘出組間的差異和其中潛在的生物標(biāo)志物。經(jīng)XCMS 軟件對圖譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理后，正、負(fù)離子模式下分別得到3 892 個和2 936 個變量。

圖1 兩組患者血漿樣本的總離子流色譜圖

為了探討早期冠狀動脈粥樣硬化患者和對照者之間的血漿代謝差異，找到與冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，本研究對早期冠狀動脈粥樣硬化組和對照組樣本進行PLS-DA 分析，結(jié)果如圖2A 和2B 所示，在正、負(fù)離子模式下，早期冠狀動脈粥樣硬化組和對照組血漿樣本幾乎完全分開，說明兩組患者體內(nèi)的代謝模式明顯不同。ESI+和ESI-對應(yīng)的模型質(zhì)量參數(shù)分別為：R2X=0.178，R2Y=0.933，Q2=0.540 和R2X=0.168，R2Y=0.943，Q2=0.356。從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。置換檢驗結(jié)果（圖2C，2D）亦證實了PLS-DA 模型的有效性。

圖2 早期冠狀動脈粥樣硬化組和對照組血漿代謝輪廓的PLS-DA 得分圖和置換驗證圖

2.3 潛在生物標(biāo)志物的篩選與鑒定

依據(jù)1.6 所述方法進行早期冠狀動脈粥樣硬化潛在生物標(biāo)志物的篩選，最終在正、負(fù)離子模式下分別篩選鑒定出20 個和22 個潛在生物標(biāo)志物，結(jié)果詳見表2。兩組間差異代謝物的變化情況采用變異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）表示，F(xiàn)C 值為歸一化的數(shù)據(jù)在兩組之間的比值（早期冠狀動脈粥樣硬化組/對照組）的對數(shù)（以2 為底數(shù)），正值代表代謝物相對含量升高；負(fù)值代表代謝物相對含量降低。與對照組相比，早期冠狀動脈粥樣硬化組患者血漿樣本中磷脂酰膽堿（PC）（14:0/14:0）、植物鞘氨醇、鞘氨醇、甘油單酯（MG）（18:2）、MG（18:3）、MG（18:1）、二十二碳六烯酸、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、二十碳三烯酸、亞油酸、亞麻酸、十五烷酸、反油酸、肉豆蔻酸、Δ2-反式-十六碳烯酸、棕櫚酸、二十碳二烯酸、3-羥基癸酸、3-（3-羥基苯基）丙酸、對甲苯基硫酸、吲哚酚硫酸、月桂?；宜?、十六碳二烯酸和癸酰乙酸這24 種代謝物含量顯著升高，而溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（18:1）、LysoPC[18:4（6Z，9Z，12Z，15Z）]、LysoPC（20:4）、LysoPC（16:0）、LysoPC（15:0）、LysoPC[22:4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、LysoPC[18:2（9Z，12Z）]、LysoPC（18:1）、LysoPC[22:6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）]、溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）（18:2）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16:0/0:0）、PE（P-16:0/0:0）、PE（42:8）、磷脂酰甘油（PG）（18:0/0:0）、甘油二酯（DG）（36:3）、DG（38:5）、硫酸普拉睪酮和L-巖藻糖 18 種物質(zhì)含量明顯降低。

表2 潛在生物標(biāo)志物信息

3 討論

本研究共篩選鑒定出42 個潛在生物標(biāo)志物，其中包括了一些磷脂類物質(zhì)，如LysoPC 和LysoPE等。它們在早期冠狀動脈粥樣硬化患者血漿中的含量相比于對照者發(fā)生了明顯的變化，且大部分物質(zhì)呈下降趨勢。磷脂不僅種類繁多，而且彼此之間可以相互轉(zhuǎn)化。其中，PC 和PE 可通過胞二磷-膽堿（CDP-膽堿）途徑合成，兩者之間還可以相互轉(zhuǎn)化，并且兩類物質(zhì)在磷酸酶A2 的水解作用下，分別生成LysoPCs 和LysoPEs。有研究表明，LysoPC和LysoPE 類物質(zhì)有助于抑制巨噬細胞的合成，阻止巨噬細胞的泡沫化，從而減少膽固醇的積累和動脈粥樣硬化的發(fā)生[8]。此外，近期一項臨床試驗發(fā)現(xiàn)，LysoPC 可降低冠心病的風(fēng)險性[9]。而我們的研究結(jié)果亦證實了這些發(fā)現(xiàn)。

本代謝組學(xué)研究顯示，MG（18:2）、MG（18:3）和MG（18:1）三種甘油單酯在早期冠狀動脈粥樣硬化患者血漿中的含量顯著上調(diào)，而DG（36:3）和DG（38:5）兩種甘油二酯類物質(zhì)在早期冠狀動脈粥樣硬化組中呈明顯下降趨勢。甘油單酯和甘油二酯均參與了甘油糖脂代謝，這說明早期冠狀動脈粥樣硬化患者體內(nèi)發(fā)生了甘油糖脂代謝的紊亂。人體內(nèi)DGs 的生成主要通過以下3 種途徑：（1）從頭合成途徑：主要是由磷脂酸在磷酸酶的作用下脫磷酸形成的；（2）由甘油三酯降解生成，該途徑主要受甘油三酯酯酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）的作用；（3）通過甘油單酯途徑合成，該過程主要由MG?；D(zhuǎn)移酶調(diào)控。而存在的DGs 一方面可以在DG?；D(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)化為甘油三酯；另一方面，可以降解生成甘油單酯和游離脂肪酸。由此可見，DGs 和MGs 在甘油三酯的合成和分解中起著核心作用。近期一項大規(guī)模隨機臨床研究證明，DGs 和MGs 是冠心病的致病因素[10]。而MGs 在甘油二酯酯酶和HSL 的催化作用下，由DGs 分解生成。進一步可在甘油單酯酯酶的作用下，降解生成甘油和游離脂肪酸。因此，DGs 和MGs 代謝紊亂可能導(dǎo)致游離脂肪酸數(shù)量的增加。過多的游離脂肪酸可以活化JNK 通路和p38 MAP-kinase 信號通路分別引起巨噬細胞的浸潤和遷移[11]。多項研究表明，巨噬細胞的浸潤和遷移在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。因此，異常的DGs 和MGs，尤其是MG（18:2）和MG（18:3），應(yīng)該與早期冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。

正常情況下，心臟活動需要的能量主要來源于脂肪酸氧化過程。本研究早期冠狀動脈粥樣硬化組患者血漿中的一些長鏈脂肪酸（例如亞油酸和亞麻酸等）水平顯著高于對照組，這可能由于在冠狀動脈粥樣硬化的條件下，心臟對氧氣的需求量超過了供氧量，機體為了彌補能量供給的不足，增強了患者體內(nèi)長鏈脂肪酸的合成，這與Zha 等[13]開展的代謝組學(xué)研究得到的結(jié)果一致，提示長鏈脂肪酸的代謝異?？赡苁怯|發(fā)冠狀動脈粥樣硬化產(chǎn)生的關(guān)鍵致病作用。

本研究發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物參與了磷脂代謝、糖脂代謝、鞘脂代謝及脂肪酸代謝，這為更加深入了解早期冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的代謝機制提供了新的信息。后續(xù)對這些代謝物及其所在代謝途徑進行深入的生物學(xué)研究，有望揭示早期冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，同時也可能為早期冠狀動脈粥樣硬化的治療或干預(yù)提供新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突