梁 楷

（中國葛洲壩集團(tuán)水務(wù)運(yùn)營有限公司，湖北 武漢 430000）

引言

由于經(jīng)濟(jì)環(huán)境的不斷擴(kuò)張，促使人類不斷擴(kuò)大了活動(dòng)范圍，在生產(chǎn)建設(shè)過程當(dāng)中產(chǎn)生的副產(chǎn)品不斷被排放到自然環(huán)境當(dāng)中，從而促使微生物的群落結(jié)構(gòu)受到影響，尤其是針對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所涉及到的化肥農(nóng)藥以及眾多具有較強(qiáng)污染的物質(zhì)，在排放到生態(tài)系統(tǒng)后，將會(huì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的影響。基于tRFLP技術(shù)的應(yīng)用，能夠清晰地分解水體環(huán)境當(dāng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)狀態(tài)，對(duì)比克隆文庫序列，從而全面呈現(xiàn)出在有機(jī)污染物排放下的水體真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[1-2]。

1 實(shí)驗(yàn)研究

1.1 材料準(zhǔn)備

由于需要對(duì)水體環(huán)境進(jìn)行采樣研究，因此需要做好充足的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，將各項(xiàng)需要使用到的試劑以及儀器等準(zhǔn)備到位，除了需要對(duì)水體環(huán)境中的水質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，也需要對(duì)水體環(huán)境中的底泥進(jìn)行研究，從而才能夠全面分析出水體環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，需要準(zhǔn)備底泥DNA 的提取試劑盒，并應(yīng)用到聚合酶載體盒、PCR 引物以及膠回收柱式產(chǎn)物回收試劑盒，準(zhǔn)備內(nèi)切酶MPI、Hhal 以及Rsal。并準(zhǔn)備電泳系統(tǒng)、紫外分光光度儀、離子色譜、測序儀測序儀337 分析軟件、Sequencher5.0、Phylip3.65[3-4]。

1.2 樣本采集水質(zhì)分析

樣本采集時(shí)間為秋季11 月上旬，選擇水體環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的河流，經(jīng)過檢測，當(dāng)日水體溫度為5 ℃，并在整條河流的上中下游各選擇不同的點(diǎn)位實(shí)施檢測，并在日常投放污染物最嚴(yán)重的點(diǎn)位再次設(shè)點(diǎn)進(jìn)行樣本采集。分別設(shè)定A、B、C、D 4 個(gè)點(diǎn)，其中，A 點(diǎn)代表生活污水相對(duì)嚴(yán)重的排放河段，B 點(diǎn)則為河流的田間流經(jīng)河段，C 點(diǎn)則為河流的直流中間段，D 點(diǎn)表示的是河流的下游主干段。在這條河流的4 個(gè)不同的點(diǎn)位分別收集水下20 cm 處的水體樣本、沉積物樣本以及深層底泥樣本，各個(gè)不同的采樣點(diǎn)位平行收集3 份，共計(jì)收集12 份樣本，并將其粘貼對(duì)應(yīng)標(biāo)簽，在冰盒中進(jìn)行保存，避免對(duì)其生物菌落結(jié)構(gòu)造成破壞，并需要保障能夠在采集樣本完成后的當(dāng)日環(huán)境當(dāng)中實(shí)施必要的水質(zhì)參數(shù)測量以及樣品的DNA 獲取。對(duì)于各項(xiàng)不同的樣本實(shí)施檢測的過程當(dāng)中，主要是對(duì)水體環(huán)境當(dāng)中具有較高有機(jī)污染物含量的水質(zhì)參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行檢測，進(jìn)一步對(duì)水質(zhì)環(huán)境中的化學(xué)需氧量以及總磷、總氮等進(jìn)行檢測[1]。分別應(yīng)用到COD 技術(shù)以及TP、離子色譜法進(jìn)行檢測。

1.3 提取DNA

應(yīng)用到離心機(jī)對(duì)水質(zhì)樣本當(dāng)中的100g 水樣進(jìn)行離心沉淀，進(jìn)而收集其產(chǎn)生的沉淀物，或是對(duì)采集的底泥樣本進(jìn)行取樣，其中應(yīng)用到土壤DNA 提取試劑盒對(duì)0.25 mg 的污泥實(shí)施檢測，提取其中的DNA 進(jìn)行分析，并在pH 值為8 的HCl 溶液中進(jìn)行溶解。在實(shí)施構(gòu)建DNA 文庫的過程當(dāng)中，需要保障能夠應(yīng)用到相對(duì)tRFLP 技術(shù)進(jìn)行集中分析，并基于16SrDNA 保守引物的基礎(chǔ)上獲取水質(zhì)樣本當(dāng)中的DNA 結(jié)構(gòu)分布，且在分析過程當(dāng)中同樣需要在引物的8F 端以及6F 端做好相應(yīng)的標(biāo)記。形成的PRC 反應(yīng)程序?yàn)?0 s下的94 ℃、40 s 下的53 ℃以及60 s 下的72 ℃，并基于這樣的反應(yīng)程序形成30 組循環(huán)效果。針對(duì)于在tRFLP 技術(shù)分析下獲得的PCR 產(chǎn)物，需要應(yīng)用到回收試劑盒進(jìn)行純化，應(yīng)用到的試劑盒種類分為膠回收以及柱式盒。并最終對(duì)PCR 產(chǎn)物應(yīng)用到HCl 溶液進(jìn)行洗脫。

1.4 tRFLP 技術(shù)分析

在MD19 載體當(dāng)中連接純化完成的PCR 產(chǎn)物，并應(yīng)用到氨芐對(duì)其陽性克隆效果進(jìn)行篩查，其中每一個(gè)對(duì)應(yīng)的樣本都需要應(yīng)用到100 個(gè)陽性克隆實(shí)施測序效果，基于Sequencher 5.0 所實(shí)施的測序結(jié)果并對(duì)其中的污染載體實(shí)施清除，并下載對(duì)應(yīng)真細(xì)菌的不同序列。純化PCR 產(chǎn)物需要應(yīng)用到內(nèi)切酶進(jìn)行消化，對(duì)消化完成的樣本取樣，其中添加相應(yīng)的ROX100 上樣緩沖液，在經(jīng)過95 ℃的性質(zhì)轉(zhuǎn)變之后實(shí)施上樣處理，并在基因測序儀當(dāng)中收集3.5 h 的3 kV 片段。使用4.5%的聚丙烯酰胺凝膠以及緩沖液實(shí)施沖洗，應(yīng)用到GenScan3.1 對(duì)其進(jìn)行分析，應(yīng)用到內(nèi)切酶軟件模擬文庫序列結(jié)構(gòu)，將GenScan 分析結(jié)果以及序列長度實(shí)施對(duì)比，進(jìn)而尋找到相應(yīng)的TRF 細(xì)菌種屬。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣本水質(zhì)結(jié)果

對(duì)淡水環(huán)境中的有機(jī)污染物的總體程度進(jìn)行研究需要借助于總磷、總氮以及COD 的相關(guān)指標(biāo)，基于我國出臺(tái)的關(guān)于地表水環(huán)境的質(zhì)量檢測報(bào)告，集中供水應(yīng)用的水體環(huán)境當(dāng)中的相關(guān)指標(biāo)需要能夠處于相對(duì)良好的COD 含量以及總磷含量狀態(tài)，二者需要小于20 mg/L 以及0.1 mg/L，并且總氮的質(zhì)量濃度為不能夠超過20.65 mg/L[2]。這樣的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合本文當(dāng)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中的點(diǎn)A、點(diǎn)B 處水體環(huán)境當(dāng)中的總磷、總氮以及COD 的實(shí)際含量超過標(biāo)準(zhǔn)，呈現(xiàn)出明顯的水質(zhì)不合格現(xiàn)象。尤其是在生活污水排放相對(duì)較為集中的A 點(diǎn)中，其水質(zhì)環(huán)境呈現(xiàn)出明顯的黑色狀顆粒物質(zhì)，并且在檢測過程當(dāng)中飄散出明顯的H2S 氣味，且周圍的植物呈現(xiàn)出相對(duì)較為茂盛的生長狀態(tài)。

而B 點(diǎn)當(dāng)中的水質(zhì)雖并無明顯的氣味，但是仍處于相對(duì)渾濁的狀態(tài)，在河道周圍附近生長香蒲與蘆葦。這兩個(gè)不同的點(diǎn)位當(dāng)中均含有大量的生活污水，這些未經(jīng)過處理的生活污水當(dāng)中存在著相對(duì)較多的有機(jī)物。且由于點(diǎn)A 處的河道其中的水流將會(huì)流經(jīng)B段后進(jìn)入到支流C 當(dāng)中，因此在這一過程當(dāng)中促使水體環(huán)境當(dāng)中的有機(jī)物質(zhì)經(jīng)過沉降并稀釋后，有效降低了水體環(huán)境當(dāng)中的總磷含量、總氮含量以及COD 含量。經(jīng)過測算，其實(shí)際的含量參數(shù)能夠達(dá)到最低標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)。且對(duì)C 點(diǎn)位實(shí)施檢測的過程中發(fā)現(xiàn)，其水質(zhì)較為清澈，且以灰白色泥沙為主。同樣的D 點(diǎn)作為在城市水源當(dāng)中的關(guān)鍵性水體環(huán)境，經(jīng)過檢測，能夠達(dá)到飲水的基本供給需求。

2.2 水體底泥中微生物群落組成

經(jīng)過實(shí)施水質(zhì)環(huán)境樣本檢測以及底泥微生物的檢測，其中的DNA 呈現(xiàn)出無色透明狀態(tài)，且產(chǎn)出率能夠達(dá)到50 μg 左右，其中的OD 系數(shù)為1.6，且濃度高達(dá)659 μg/L，整體片段約為23并無明顯的降解效果，DNA 污染程度相對(duì)較差。通過全面檢測并克隆測序，底泥樣本的AS3 以及DS3 在完成拼接后呈現(xiàn)出77 條與73 條序列狀態(tài)，經(jīng)過GenScan 的相似性檢測，其中＞97%的序列建立形成相同的操作單元結(jié)構(gòu)，并在其中發(fā)現(xiàn)了基于OTU 的存在，并且在D 段當(dāng)中的水體環(huán)境當(dāng)中對(duì)底泥進(jìn)行檢測，其中Proteobacteria 占比能夠達(dá)到21.9%，β Proteobadteria 的實(shí)際占比為10.96%，Bacteroidetes 實(shí)際含量為19.8%，Deinococcus Thermus的含量占比為17.18%。相對(duì)來講，這些結(jié)構(gòu)在A 段的水體環(huán)境當(dāng)中的占比相對(duì)較為集中，Proteobacteria 的實(shí)際占比能夠達(dá)到47%左右。

2.3 tRFLP 技術(shù)下的微生物結(jié)構(gòu)相似性

在對(duì)該河段實(shí)施檢測的過程當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，基于4 個(gè)不同點(diǎn)位的共計(jì)12 個(gè)不同的樣本當(dāng)中測試獲得的圖譜呈現(xiàn)出明顯的多樣性結(jié)構(gòu)狀態(tài)，基于50 條帶的平均分布結(jié)果，形成數(shù)字化的泳道條帶，基于一致的遷移標(biāo)準(zhǔn)下，存在則無論數(shù)值多少記為1，無則記為0[3]。而最終的分析結(jié)果證明，在多個(gè)水體環(huán)境當(dāng)中的真細(xì)菌生物群落以及污泥當(dāng)中的真細(xì)菌生物群落呈現(xiàn)出相對(duì)較為獨(dú)特的效果，基于嚴(yán)重污染狀態(tài)下A 點(diǎn)以及B 點(diǎn)結(jié)構(gòu)中的實(shí)際生物群落狀態(tài)與C 點(diǎn)以及D 點(diǎn)之間呈現(xiàn)出分割的污染群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而相應(yīng)的形成了基于獨(dú)立存在的微生物群體結(jié)構(gòu)。應(yīng)用到完整的限制性內(nèi)切酶對(duì)A 及D 點(diǎn)樣本形成的文庫序列實(shí)施模擬酶切后，形成的序列長度對(duì)比GenScan 下的條帶長度，進(jìn)而獲取到相應(yīng)的生物結(jié)構(gòu)狀態(tài)，進(jìn)過對(duì)比能夠完全與文庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果相吻合。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

3.1 水體污染降低細(xì)菌多樣性，富集特殊微生物群落

結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析完成后所獲得的水樣物質(zhì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的取樣點(diǎn)A 處存在著明顯的有機(jī)物污染狀況，而對(duì)比發(fā)現(xiàn)，D 點(diǎn)的水質(zhì)條件相對(duì)較好，對(duì)比不同的理化指標(biāo)以及群落組織結(jié)構(gòu)，其中水體環(huán)境下的底泥由于受到人為影響的程度相對(duì)較小，因此所形成的真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性較為豐富，能夠形成相對(duì)寬泛的生態(tài)位，并形成更加穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。而排污溝附近的底泥環(huán)境中，由于受到COD 的影響作用，因此其中的微生物群落接受呈現(xiàn)出特定的微生物富集狀況，基于單一化的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，難以構(gòu)成相對(duì)較為穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)，如若遇到外界環(huán)境變化較大時(shí)，則會(huì)促使整體的生態(tài)系統(tǒng)處于崩潰狀態(tài)。

因此在生態(tài)學(xué)當(dāng)中闡述，關(guān)于生態(tài)位進(jìn)行交叉時(shí)則能夠相應(yīng)地產(chǎn)生明顯的種群優(yōu)勢(shì)效果，則會(huì)通過改變生物類群的數(shù)量進(jìn)行彌補(bǔ)，才能夠保障始終處于穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)造當(dāng)中，避免外部干擾侵襲。而在水體環(huán)境當(dāng)中，所形成的污染物程度越高則相應(yīng)地會(huì)降低生物多樣性。正如在水體環(huán)境當(dāng)中防治的廢水處理器，在啟動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生相對(duì)較多的生物結(jié)構(gòu)群落，但是隨著使用過程，形成單一的生物馴化狀態(tài)，進(jìn)而促使微生物多樣性受損，關(guān)于廢水處理的微生物類群將會(huì)呈現(xiàn)出富集狀態(tài)。因此，在治理水污染環(huán)境時(shí)，需要盡可能避免排放大量高濃度污染物。這是由于，在污染水體環(huán)境當(dāng)中已然造成相對(duì)較為富集的水體環(huán)境狀態(tài)，如若大量排水，則會(huì)促使其中的微生物富集群落逐漸流失，從而影響到生態(tài)結(jié)構(gòu)。并且由于水體環(huán)境已經(jīng)遭受污染，可以嘗試對(duì)降解污染物的微生物實(shí)施富集處理，進(jìn)而完全形成降解污染物的效果后，基于底物的存在，機(jī)會(huì)重新建立真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

3.2 微生物群落取決于水質(zhì)，并由外界因素決定分布

由于在本次實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中采集到的水樣以及底泥等呈現(xiàn)出相對(duì)較為明顯的結(jié)構(gòu)相似性，因此將A、B點(diǎn)設(shè)定為一組對(duì)比觀察數(shù)據(jù)，而C、D 組則同樣設(shè)定為對(duì)比觀察數(shù)據(jù)，這樣的真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性模擬實(shí)驗(yàn)主要是基于在同一水體環(huán)境所產(chǎn)生的[4]。因此，經(jīng)過對(duì)兩組不同的水質(zhì)環(huán)境進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，獲得的顯著差異性成果其中表明了關(guān)于樣本當(dāng)中的COD明顯差別狀態(tài)，同時(shí)總氮以及總磷的實(shí)際含量差別相對(duì)較小。因此則在一定程度上證明了基于微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性，極大程度上取決于水質(zhì)環(huán)境的相似性。則可以通過這樣的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在相似的水質(zhì)環(huán)境當(dāng)中可以對(duì)其中含有的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比推斷。

但是需要注意的是，在水質(zhì)環(huán)境當(dāng)中的COD 等相關(guān)參數(shù)等，無法基于瞬時(shí)變化影響到生物種群的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，因此需要應(yīng)用到分子生物學(xué)對(duì)真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。并且由于在實(shí)際當(dāng)中的水體環(huán)境以及沉積物處于差異化的生態(tài)介質(zhì)狀態(tài)當(dāng)中，主要是能夠形成差異化的微生物群類效果，基于在實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的水體環(huán)境以及底泥環(huán)境當(dāng)中的微生物種類進(jìn)行分析，進(jìn)一步證明了水體與底泥將會(huì)形成不同的真細(xì)菌生物群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)語

基于近年來在水資源緊缺環(huán)境下的應(yīng)用，造成的水體污染十分嚴(yán)重，而對(duì)這樣的現(xiàn)象實(shí)施有效地解決處理，則需要進(jìn)一步建立在全面分析水體環(huán)境當(dāng)中的真細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，本文通過實(shí)驗(yàn)證明，在處理水體環(huán)境當(dāng)中的有機(jī)污染物時(shí)需要盡可能地降低對(duì)原有的生態(tài)環(huán)境所造成的破壞，對(duì)特殊微生物群落進(jìn)行富集，從而降解污染物，達(dá)到凈化水體的作用。