郭 瓊，王曉瑜，潘立寧，楊乾栩，謝復煒，郭吉兆，劉惠民*，陳滿堂，朱保昆，張 偉*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號 650231

醛酮類化合物是卷煙主流煙氣中重要的致香成分。同時，一些小分子醛酮如甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛具有感官刺激性，且被列入了煙氣44種有害成分的“霍夫曼清單”［1］。目前對于卷煙煙氣醛酮類化合物的研究聚焦在煙氣中小分子醛酮類刺激性成分，較少涉及煙氣醛酮類香味成分的系統(tǒng)分析。2008 年，丁時超等［2］采用2，4-二硝基苯肼衍生-LC-MS/MS 法測定了卷煙樣品主流煙氣中的甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、巴豆醛、甲基丙烯醛、2-丁酮、丁醛、苯甲醛、戊醛和己醛等32種醛酮類化合物；Ding等［3］對卷煙主流煙氣7種小分子醛類有害成分原位衍生，使用UPLC-MS/MS進行定量檢測；Pauwels 等［4］研究了不同吸煙行為和卷煙設計對卷煙主流煙氣中12種小分子醛類有害成分釋放量的影響。在煙氣醛酮類香味成分分析研究方面，Pieraccini 等［5］建立了 SPME-GC-MS 法并對不同品牌卷煙主流煙氣和側流煙氣中11種醛酮類香味成分進行定量分析；Schwanz 等［6］采用GC×GC-TOFMS法分析不同煙草品種的主流煙氣成分，鑒定出46種醛酮類化學感官標記物。然而，有限的幾篇關于醛酮類香味成分的報道主要是基于非靶標相對定量方法［5-7］，且檢測指標均不超過50種。

近年來，國內細支和中支卷煙銷量快速增長，已成為煙草企業(yè)和消費市場關注的熱點之一［8］。但目前關于不同規(guī)格卷煙煙氣成分釋放量的研究主要集中在細支和常規(guī)卷煙在煙氣常規(guī)成分、部分有害成分及香味成分釋放量的比較上［9-11］，而關于中支卷煙與細支、常規(guī)卷煙主流煙氣差異的研究較少。由于不同規(guī)格的卷煙圓周、煙支長度、濾嘴通風率等均不同，可能引起卷煙燃燒狀態(tài)以及煙氣成分在煙柱中的傳輸、擴散過程發(fā)生改變，影響煙氣成分的釋放量。而卷煙主流煙氣中醛酮類化合物的沸點分布范圍寬，不僅包括了多糖類、果膠和蛋白質熱裂解的產物，還涵蓋煙草非酶棕色化反應形成并直接遷移至煙氣中的重要香味組分［12］。因此，研究不同規(guī)格卷煙主流煙氣醛酮類成分釋放量差異，可進一步揭示卷煙煙氣釋放規(guī)律。因此，本研究中從國內外煙草添加劑清單及煙草和煙氣香味成分分析文獻中篩選出158 種醛酮類成分，針對不加香卷煙中可檢出的95 種醛酮類香味成分構建了高通量、高靈敏的GC-MS/MS 絕對定量分析方法，并對方法進行了系統(tǒng)表征；采用構建方法和YC/T 254—2008［13］的方法檢測了相同煙絲制備的細支、中支和常規(guī)規(guī)格卷煙主流煙氣中的95 種醛酮類香味成分、8 種刺激性的小分子醛酮成分，采用單因素方差分析（ANOVA）法篩選差異化合物，探討了不同規(guī)格卷煙主流煙氣醛酮類成分的釋放規(guī)律，旨在為卷煙產品的開發(fā)和維護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

31種醛類和64種酮類化合物標準品（＞95%，美國Sigma Aldrich公司、北京百靈威科技有限公司、加拿大TRC 公司、江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司或上海畢得醫(yī)藥科技有限公司）；苯乙烯-d（8＞99%，北京百靈威科技有限公司）；苯乙酮-d（8＞99%，美國Sigma Aldrich公司）；二苯甲酮-d10、鄰苯二甲酸二異丁酯-d（4＞98%，加拿大TRC 公司）；二氯甲烷（色譜純，美國J & T Baker 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore公司）。

7890-7010 型氣相色譜/三重四極桿質譜聯(lián)用儀、DB-5MS UI 彈性石英毛細管柱（60 m× 0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）、DB-624 彈性石英毛細管柱（60 m×0.25 mm i.d.×1.4 μm d.f.）、進樣口端串聯(lián)預柱（5 m×0.25 mm i.d.）（美國Agilent公司）；SM450直線型吸煙機（英國Cerulean 公司）；Sigmole-NYL1111A有機相濾膜（尼龍，13 mm×0.22 μm，上?？泼鸦瘜W科技有限公司）；44 mm 劍橋濾片（德國Borgwaldt K C 公司）；KQ-500DE 超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP224S型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）。

烤煙型葉組由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供。收集了17個市售中支卷煙產品（覆蓋國內14家工業(yè)企業(yè)）和149 個市售國產烤煙型細支卷煙產品（覆蓋國內15家工業(yè)企業(yè)），均有較好的代表性。根據市售細支、中支和常規(guī)卷煙物理參數的實際分布情況（表1），參考3 種類型卷煙的主流設計規(guī)格，采用相同煙絲（無添加劑）和相同卷煙紙制備細支、中支和常規(guī)實驗卷煙樣品。

表1 市售細支、中支卷煙物理參數分布①Tab.1 Distribution of physical parameters of slim and medium cigarettes

1.2 方法

1.2.1 卷煙物理參數分析

采用 GB/T 22838—2009［14］的方法測定細支、中支和常規(guī)卷煙樣品的質量、吸阻、濾嘴通風率、總通風率和圓周等物理參數，結果見表2。

表2 3種類型卷煙樣品的物理參數Tab.2 Physical parameters of cigarette samples of three sizes

1.2.2 樣品處理

按照 GB/T 16447—2004［15］的要求，將卷煙樣品在（22±1）℃、相對濕度（60±3）%的環(huán)境中平衡48 h后，挑選平均質量±0.020 g和平均吸阻±30 Pa的煙支作為測試樣品。采用ISO 抽吸模式，用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣中粒相物；在劍橋濾片捕集器后連接兩個串聯(lián)的吸收瓶，每個吸收瓶中盛有10 mL 甲醇，將其置于異丙醇-干冰冷卻（-78 ℃）的冷阱中，用于捕集主流煙氣氣相物。卷煙抽吸完畢后，將劍橋濾片對折，置于12 mL樣品瓶中；加入10 mL二氯甲烷，并加入50 μL內標溶液，超聲萃取30 min；取萃取液，用一次性過濾器（注射器中裝有有機相濾膜）過濾，收集濾液。

氣相部分操作：在每個吸收瓶中準確加入50 μL內標溶液，攪拌均勻；各取1 mL溶液于色譜瓶中，加入50 μL 分析物保護劑。其中，內標溶液為苯乙烯-d8、苯乙酮-d8、二苯甲酮-d10和鄰苯二甲酸二異丁酯-d4，濃度均為0.12 mg/mL；分析物保護劑溶液為辛二醇、壬二醇或十四醇，濃度均為20 mg/mL。

1.2.3 8種小分子醛酮類刺激性成分分析

采用YC/T 254—2008［13］的方法測定卷煙主流煙氣中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮和丁醛的釋放量。

1.2.4 95種醛酮類香味成分分析

氣相物和粒相物萃取液樣品均取兩份，分別在DB-5MS 和DB-624 兩根色譜柱上分離分析。GC-MS/MS分析條件：

方法一：

方法二：

2 結果與討論

2.1 GC-MS/MS儀器參數優(yōu)化

對95 種醛酮類香味成分建立GC-MS/MS 分析方法，程序升溫條件等色譜參數的優(yōu)化主要以提高多靶標分析物之間、靶標物與基質干擾成分之間的分離度為準則優(yōu)化確定，如1.2.4 節(jié)所述。本研究中重點優(yōu)化的質譜參數主要有母離子、子離子和碰撞能量。對目標物及內標的標準品溶液進行全掃描和子離子掃描，選擇合適的母離子和子離子；根據響應信號強弱、煙氣基質干擾情況，確定定性、定量離子對。各化合物的優(yōu)化結果見表3。同時考慮到卷煙主流煙氣釋放量在10 μg/支以上的醛酮類成分，如2，5-二甲基-4-羥基-3-（2H）-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、茄酮和糠醛等，應選擇豐度較低的離子對，以避免質譜響應飽和。由于95 種醛酮類成分沸點在93.5～323.0 ℃之間，采用一根色譜柱難以兼顧低沸點和高沸點醛酮類成分均與干擾基質良好分離，因此使用非極性的DB-5MS 色譜柱和中等極性、厚液膜的DB-624色譜柱分別對38種和57種醛酮類香味成分進行分離分析。

表3 95 種醛酮類化合物及其內標的MRM 參數①Tab.3 MRM parameters of 95 aldehydes and ketones compounds and their internal standards

表3（續(xù)）

表3（續(xù)）

2.2 方法評價

2.2.1 標準曲線、精密度、檢測限和定量限

以二氯甲烷為溶劑配制標準溶液，并加入分析保護劑（Analyte protectant，AP），采用內標定量法，實驗過程中均以5個標準濃度點繪制標準曲線。用實驗室參比卷煙煙氣樣品溶液，以MRM 方式采集，考察95 種醛酮類香味成分測定方法的定量限（LOQ），以10 倍信噪比計算LOQ。在1 d 內（5 個平行抽吸）、連續(xù)5 d（每天1個平行抽吸）進行日內及日間精密度測定，計算相對標準偏差（RSD）。由表4可知，各化合物均有良好的線性關系（R2＞0.99），85 種化合物的 LOQ 在 0.9～100.0 ng/支之間；有 9 種化合物在煙氣中的釋放量較高，在1.1～624.4 μg/支之間，如2，5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、茄酮和反-2-癸烯醛等，LOQ為100.0～3 134.6 ng/支。日內和日間RSD 范圍分別為1.4%～11.1%和0.7%～24.3%（其中70 個化合物的RSD＜10%）。因此該方法重復性、靈敏度和準確度較好，適用于卷煙主流煙氣醛酮類成分的分析。

2.2.2 基質效應

在GC分析中，基質效應通常表現(xiàn)為基質誘導增強［16］，即由于存在活性位點，導致相同質量分數待測物在實際樣品中的響應值高于純溶劑中的響應值，造成基質加標的回收率偏高。目前基質效應的補償方法主要有基質匹配標準溶液法［17］和加入分析保護劑法［18］。但是不同于農殘分析領域，對于煙氣香味成分分析來說，無法找到煙氣空白基質，因此本研究中采用加入AP法。AP能有效掩蓋進樣口和色譜系統(tǒng)的活性位點，可降低活性位點對目標物的吸附作用，是補償基質效應的有效手段。如Claudia等［19］檢測小麥胚芽中120 種農藥，在標樣溶液中加入1，2，3-戊三醇、L-古洛糖酸內酯和山梨醇作為AP，89%農藥的回收率可達70%～120%；林曉燕等［20］測定蔬菜中43種農藥殘留時添加AP后，發(fā)現(xiàn)AP具有顯著的基質補償作用，能夠實現(xiàn)對基質敏感農藥的保護。由于AP 的氫鍵能力和揮發(fā)性是影響基質效應補償效果的重要因素［21］，因此本研究中選用帶多羥基的二元醇類化合物（辛二醇、壬二醇、十四醇）作為AP?？疾炝?.2 mg/L各目標物在溶劑與“溶劑+AP”中的色譜峰，12 種物質在“溶劑+AP”/溶劑中的絕對響應比大于2，如4-（4-羥基苯基）-2-丁酮的絕對響應增加了8.2 倍，姜酮的絕對響應增加了4.4 倍。對比了配制溶劑和“溶劑+AP”標準溶液繪制的標準工作曲線，結果表明，溶劑標準溶液繪制標準曲線時，β-萘乙酮、4-（2-呋喃基）-3-丁烯-2-酮、3，4-二甲氧基苯甲醛、姜酮和丁香醛存在明顯的基質效應，100 ng/mL 濃度點無信號響應。加入AP 后，待測物的響應和峰型均得到較好改善?！叭軇?AP”標準曲線的線性相關性良好，95 種目標物的R2均大于0.99（表4）。

表4 95 種醛酮類化合物的標準工作曲線、回收率、相對標準偏差和定量限（n=5）Tab.4 Calibration curves, recoveries, relative standard deviations and limits of quantification for 95 aldehydes and ketones compounds（n=5）

表4（續(xù)）

按照參比卷煙主流煙氣醛酮類成分釋放量的50%、100%和200%，向劍橋濾片上分別加入低、中、高3 個濃度水平的標樣，計算加標回收率。95 個化合物中，有92個化合物的回收率在70%～120%之間，因此本研究中通過加入AP 有效地補償了基質效應。而針對其余3 個目標成分，擬采用凈化、稀釋、AP組合考察等方式進一步開展研究。

2.4 不同規(guī)格卷煙主流煙氣醛酮類成分釋放量

測定了不同規(guī)格的18個卷煙樣品煙氣中的8種小分子醛酮類刺激性成分、95 種醛酮類香味成分的釋放量。為進一步分析細支、中支和常規(guī)卷煙煙氣中差異顯著的成分，對數據進行單因素方差分析，共篩選出68 種差異成分（P＜0.01），對卷煙主流煙氣醛酮類成分的單位焦油釋放量在氣相物與粒相物中分布的比值（氣粒比）以及沸點進行統(tǒng)計（表5）。

表5 68 種差異醛酮類成分的單位焦油釋放量、氣粒比、F 值、P 值和沸點Tab.5 Releases per unit tar，gas-particle ratios，F(xiàn) values，P values and boiling points of 68 different aldehydes and ketones components

表5（續(xù)）

表5（續(xù)）

由表5可知，在細支、中支和常規(guī)卷煙中，不同沸點化合物單位焦油釋放量的差異較大。對于沸點≤133 ℃的16 種醛酮類成分，常規(guī)卷煙煙氣釋放量高于中支和細支卷煙；沸點≥215 ℃的21 種醛酮類成分僅在粒相中檢出，除3-甲基苯乙酮和肉桂醛外，常規(guī)卷煙煙氣釋放量顯著低于中支和細支卷煙；對于沸點在133～215 ℃間的31個差異醛酮類成分，除2-庚酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮外，中支卷煙煙氣釋放量高于細支和常規(guī)卷煙。這可能是由于3種不同規(guī)格卷煙的濾嘴通風率、煙支圓周和長度等參數不同造成的結果。為進一步分析原因，采用寬度為19 mm 的Scotch 膠帶單層纏繞濾嘴1圈，100%堵塞濾嘴通風孔，對比分析無濾嘴通風時3種規(guī)格卷煙主流煙氣釋放量。

對于沸點≤133 ℃的成分，如2-己酮、2，3-戊二酮和3-戊烯-2-酮，其氣粒比＞1（圖1）。如2-己酮在常規(guī)、中支和細支卷煙煙氣中的氣粒比分別為7.73、7.40和8.80，主要分布在氣相中，有濾嘴通風時，其單位焦油釋放量：常規(guī)＞中支＞細支卷煙；無濾嘴通風時，細支卷煙煙氣中的單位焦油釋放量最低，乙醛和3-戊烯-2-酮的中支卷煙單位焦油釋放量最高，2-己酮和2-丁酮的常規(guī)卷煙煙氣單位焦油釋放量最高。且與無濾嘴通風相比，有濾嘴通風時中支和細支卷煙單位焦油釋放量降低趨勢更明顯。這可能是圓周和濾嘴通風交互作用的結果。在圖1b中，常規(guī)、中支和細支卷煙的濾嘴通風率分別為0、12.5%、33.3%（表2）。濾嘴通風率增加，改變了熱解條件，進而改變了煙氣釋放量，導致燃燒錐周圍以及進入煙支的空氣流速降低，煙氣停留時間延長，使一部分低沸點成分未進入煙支而擴散損失；同時流經濾嘴的煙氣流速較低，過濾效率提高，煙氣釋放量降低。但不同成分單位焦油釋放量的降低幅度不同，大多數揮發(fā)性成分的釋放量降低程度較大，半揮發(fā)性成分則較小［22］。這與景延秋等［23］的不同濾嘴稀釋度對卷煙主流煙氣重要香味成分輸送量影響的結論一致，分子量越小的香味成分的輸送量越易隨濾嘴通風率的增大而減少。但甲醛釋放量在不同規(guī)格卷煙中沒有顯著差異，這可能是由于甲醛釋放量伴隨氣流量的增大而增加［24］，又隨濾嘴通風導致的擴散稀釋而減少，兩者交互作用的結果。在圖1a中，無濾嘴通風時，這5 種低分子量成分在細支卷煙煙氣中的單位焦油釋放量最低，中支和常規(guī)卷煙與有濾嘴通風時釋放情況有所差異。這可能是圓周導致3種規(guī)格卷煙的燃燒狀態(tài)不同引起的。田忠等［25］研究發(fā)現(xiàn)細支卷煙的峰值抽吸溫度＜600 ℃，明顯低于常規(guī)卷煙（800～1 000 ℃）。熱裂解溫度對不同類型化合物釋放量的影響有差異，如400～600 ℃時呋喃酮、吡喃酮和酚類化合物的釋放量最大，1 000 ℃時氮雜環(huán)類化合物和呋喃的釋放量最大［26］。

圖1 沸點≤133 ℃的成分分別在無濾嘴通風（a）和有濾嘴通風（b）時在常規(guī)、中支和細支卷煙主流煙氣中單位焦油釋放量的歸一化結果Fig.1 Normalized releases per unit tar of components with boiling points ≤133 ℃ in mainstream smoke of king-sized，medium and slim cigarettes without（a）and with（b） filter ventilation

對于沸點≥215 ℃的成分，除3-甲基苯乙酮和肉桂醛外，如甲基環(huán)戊烯醇酮、香蘭素、5-羥甲基糠醛、麥芽酚和乙基環(huán)戊烯醇酮等，在無濾嘴通風和有濾嘴通風時，細支卷煙單位焦油釋放量均高于中支和常規(guī)卷煙（圖2）。由于這些成分分布在粒相物中，濾嘴通風對半揮發(fā)性組分釋放量降低的影響較小，引起的稀釋、擴散作用可忽略不計。圓周不同導致煙氣煙支軸向傳輸速度以及燃燒狀態(tài)改變應是主要的影響因素。相關研究［22，27］也證實了這一解釋：一方面，與常規(guī)卷煙相比，細支和中支卷煙煙絲燃燒得更加充分。崔曉夢等［27］對比分析了不同圓周卷煙的升溫速率，結果表明，圓周越小，抽吸過程中燃燒錐內部升溫速率越高。細支卷煙的升溫速率較高，有利于高分子量、高沸點化合物生成。另一方面，細支煙的橫截面積為常規(guī)卷煙的48.2%，為中支卷煙的70.3%，在標準抽吸條件下，細支卷煙煙氣通過煙支軸向的流速大于中支和常規(guī)卷煙，煙絲段對高分子量、高沸點組分的冷凝和過濾時間減少，導致煙氣組分單位焦油釋放量較高［22］。

圖2 沸點≥215 ℃的成分分別在無濾嘴通風（a）和有濾嘴通風（b）時在常規(guī)、中支、細支卷煙主流煙氣中單位焦油釋放量的歸一化結果Fig.2 Normalized releases per unit tar of components with boiling points ≥215 ℃ in mainstream smoke of king-sized，medium and slim cigarettes without（a）and with（b） filter ventilation

對于沸點在133～215 ℃之間的31個差異醛酮類成分（除2-庚酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮外），在有濾嘴通風時，其中支卷煙煙氣單位焦油釋放量較細支和常規(guī)卷煙高，如乙偶姻、3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、糠醛、5-甲基糠醛、2-環(huán)戊烯-1-酮等（表5）。這可能是中支卷煙的濾嘴通風率、吸阻、煙支圓周和長度等物理參數數值在細支和常規(guī)卷煙之間，多種因素交互作用導致的結果，影響主流煙氣的形成，最終造成各成分釋放量的差異。具體的影響機理仍需進一步研究。

綜合來看，相同煙絲在細支、中支和常規(guī)卷煙下，醛酮類成分的釋放量和組成比例均發(fā)生顯著變化，且與化合物的沸點密切相關。這種差異可能是多種因素綜合作用的結果，如濾嘴通風影響煙氣擴散稀釋、煙支圓周導致軸向傳輸速度差異和燃燒狀態(tài)的改變等。

3 結論

①基于GC-MS/MS 建立了測定卷煙主流煙氣中95種醛酮類香味成分的定量分析方法，與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有高通量、高靈敏度和準確定性定量等優(yōu)點。②對于常規(guī)、中支和細支卷煙實際樣品的檢測，可以較好地區(qū)分不同規(guī)格的卷煙樣品，可用于卷煙主流煙氣醛酮類香味成分的分析。③常規(guī)、中支和細支卷煙主流煙氣中各醛酮類成分的單位焦油釋放量和化合物沸點相關：對于沸點≤133 ℃的成分，常規(guī)卷煙煙氣中的釋放量高于中支和細支卷煙；對于沸點≥215 ℃的成分（3-甲基苯乙酮和肉桂醛除外），常規(guī)卷煙煙氣中的釋放量顯著低于中支和細支卷煙；對于沸點在133～215 ℃之間的成分（2-庚酮、2-甲基四氫呋喃-3-酮和6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮除外），中支卷煙的釋放量高于細支和常規(guī)卷煙。