蔣 程，許平翠，吳人杰，張曉芹，陳禮平，王娜妮（.浙江省立同德醫(yī)院,浙江 杭州 300；.浙江省麗水市中醫(yī)院,浙江 麗水 33000）

畬藥地稔（地菍）是野牡丹科植物地稔（MelastomadodecandrumLour.）的新鮮或干燥全草，臨床常用于帶狀皰疹、盆腔炎、風(fēng)濕骨痛等病癥的治療，是宮炎平片和紫地寧血散等中成藥的重要組成[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-3]表明，地稔提取液具有清除氧自由基、抑制人紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、提高小鼠血清超氧化物歧化酶活性等作用，有較強(qiáng)的抗氧化活性。常見的抗氧化活性測(cè)定方法有1,1-二苯基-2-苦腈基自由基（DPPH）法、2,2'-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽法、鐵離子自由基法等，操作煩瑣、費(fèi)時(shí)[4]。近年來，基于DPPH 的在線色譜分析法[5]大大提高了抗氧化活性的分析效率，但完成測(cè)定仍普遍需要30 min 以上的時(shí)間。光譜技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。目前，已有研究將食品的光譜學(xué)特征與抗氧化活性直接關(guān)聯(lián)，建立了茶葉、冬棗等抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)方法[6-9]，但采用紫外光譜技術(shù)快速預(yù)測(cè)地稔的抗氧化活性尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。課題組前期已建立了基于近紅外光譜的地稔水提液抗氧化活性快速預(yù)測(cè)方法[10]。在前期基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步建立了基于紫外光譜和偏最小二乘（partial least squares,PLS）回歸算法的地稔水提液抗氧化活性快速預(yù)測(cè)方法，并開發(fā)了應(yīng)用軟件。采集待測(cè)地稔水提液的紫外光譜后，通過軟件中的預(yù)測(cè)功能可在2 s 內(nèi)得到抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)結(jié)果。本研究可為進(jìn)一步完善地稔抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DPPH（Sigma-Aldrich 公司）。無水乙醇（分析純，浙江省無錫市展望化工試劑有限公司）。去離子水由Smart2pure 超純水系統(tǒng)制備（Thermo，美國）。共收集10 批地稔藥材，經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院俞忠明副主任中藥師鑒定為地稔（Melastoma dodecandrum Lour.），陰干密封保存。紫外光譜采集采用2 450 系列紫外-可見分光光度儀（島津，日本）。DPPH 自由基清除活性吸光度測(cè)定采用SpectraMax 190 酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）。

1.2 數(shù)據(jù)采集

稱取地稔藥材各約5.0 g，分別加入料液比為1∶25～1∶45 的去離子水，浸泡30 min，加熱回流提取1.5～3.5 h，抽濾后的提取液水浴濃縮后轉(zhuǎn)移至50 ml 量瓶，用去離子水定容，共得到34 批地稔水提液，采用DPPH 法測(cè)定其抗氧化活性。地稔水提液的制備條件和抗氧化活性測(cè)定方法見文獻(xiàn)[10]。

移取地稔水提液40 μl，加入去離子水3 960 μl，10 000 r/min 離心后取上清液，制得樣品溶液。用1 cm 光程的石英比色皿采集紫外光譜。光譜掃描波長范圍為190～600 nm，波長間隔為1 nm，掃描速度為快速。每次分析前用去離子水校正儀器基線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以抗氧化活性為Y，以紫外光譜矩陣為X，通過留一法交叉驗(yàn)證確定最優(yōu)主成分?jǐn)?shù)，建立X對(duì)Y的PLS 回歸模型。采用校正集相關(guān)系數(shù)（Rcal）、擬合均方根誤差（RMSEE）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSEcv）、驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)（Rval）和預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）對(duì)模型的準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。首先，比較不同起始波長和終止波長的建模結(jié)果，優(yōu)化光譜波長范圍。繼而比較原始光譜和光譜經(jīng)中心化、標(biāo)準(zhǔn)化、Savitsky-Golay（SG）平滑結(jié)合一階導(dǎo)數(shù)、SG 平滑結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)、多源散射校正、標(biāo)準(zhǔn)正則變換等預(yù)處理后的建模結(jié)果，優(yōu)化光譜預(yù)處理方法。最后，基于最優(yōu)PLS 回歸模型開發(fā)應(yīng)用軟件。數(shù)據(jù)處理采用SIMCA-P+軟件（版本12.0，Umetrics AB，瑞典）。應(yīng)用軟件開發(fā)采用Visual Basic 軟件（版本6.0，Microsoft，美國）。

2 結(jié)果

2.1 光譜波長范圍優(yōu)化

地稔水提液的抗氧化活性范圍為83.4%～98.9%。樣品溶液的紫外光譜見圖1。隨機(jī)選擇24 個(gè)樣品作為校正集，剩下10 個(gè)樣品作為驗(yàn)證集。采用校正集樣品，以抗氧化活性為Y，以190 nm為起始波長，分別以250、280、290、300、400、600 nm為終止波長，將紫外光譜經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后建立PLS 回歸模型，優(yōu)化終止波長，見圖2A。結(jié)果表明，以290 nm 為終止波長所建模型的RMSEcv 最小。以抗氧化活性為Y，分別以190、200、210、220 nm為起始波長，以290 nm 為終止波長，將紫外光譜經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后建立PLS 回歸模型，優(yōu)化起始波長，見圖2B。結(jié)果表明，當(dāng)起始波長為200 nm 時(shí)所建模型的RMSEcv 最小。綜上所述，本研究選擇200～290 nm 為最優(yōu)波長范圍。

圖1 樣品溶液的紫外光譜圖

圖2 基于不同波長的PLS 回歸結(jié)果

2.2 光譜預(yù)處理方法優(yōu)化

以抗氧化活性為Y，采用200～290 nm 的紫外光譜，比較原始光譜和光譜經(jīng)不同預(yù)處理后的建模結(jié)果，優(yōu)化光譜預(yù)處理方法，結(jié)果見表1。綜合考慮Rcal、RMSEE、RMSEcv 等，本研究選擇標(biāo)準(zhǔn)化為最優(yōu)光譜預(yù)處理方法。

表1 基于不同預(yù)處理方法的PLS 回歸結(jié)果

2.3 模型應(yīng)用

采用200～290 nm 的紫外光譜，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后建立最優(yōu)PLS 回歸模型，校正集預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖（圖3），Rcal、RMSEE、RMSEcv 分別為0.887、2.20%、2.17%。基于最優(yōu)PLS 回歸模型開發(fā)應(yīng)用軟件，將所建預(yù)測(cè)模型嵌套入軟件。軟件雙擊即可打開，操作界面見圖4。采用該應(yīng)用軟件，通過2 個(gè)步驟即可實(shí)現(xiàn)待測(cè)地稔水提液抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)。步驟1：將待測(cè)地稔水提液稀釋后，采集紫外光譜，檢測(cè)波長為200～290 nm。步驟2：通過軟件中的預(yù)測(cè)功能將紫外光譜數(shù)據(jù)自動(dòng)代入模型，在2 s 內(nèi)實(shí)現(xiàn)地稔水提液抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)。

圖3 抗氧化活性最優(yōu)PLS 回歸模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值相關(guān)圖

圖4 地稔水提液抗氧化活性預(yù)測(cè)軟件操作界面

2.4 方法驗(yàn)證

采用所開發(fā)的軟件預(yù)測(cè)驗(yàn)證集樣品的抗氧化活性。對(duì)比驗(yàn)證集抗氧化活性的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值，驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證集預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的相關(guān)圖見圖3，預(yù)測(cè)回收率見表2。結(jié)果顯示，驗(yàn)證集抗氧化活性的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值差異較小，Rval、RMSEP 分別為0.868、2.08%，平均預(yù)測(cè)回收率為（100.1±2.3）%，表明該方法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較高。

表2 驗(yàn)證集抗氧化活性的預(yù)測(cè)回收率（%）

3 討論

地稔是我國的民間常用藥，在畬族等少數(shù)民族民眾中廣泛應(yīng)用，具有較好的臨床價(jià)值，但仍缺少有效的質(zhì)量控制方法。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地稔提取液有較強(qiáng)的抗氧化活性，但不同采收時(shí)間、不同部位地稔的質(zhì)量有較大的差異[12-13]。因此，建立地稔抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)方法對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，將光譜技術(shù)應(yīng)用于食品、中藥等抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[6-9,14]，但多以近紅外光譜為主。紫外光譜是一種基于分子中價(jià)電子能級(jí)躍遷的電子光譜技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)便、綠色、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)。目前，紫外光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的快速預(yù)測(cè)[15-17]，但在中藥抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)方面仍罕見文獻(xiàn)報(bào)道。課題組前期研究表明，地稔水提液紫外光譜的吸光度與其活性成分沒食子酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚的含量具有相關(guān)性[11]。另有研究表明，地稔水提液的抗氧化活性與多種活性成分的含量呈濃度依賴性[18]?；谏鲜鼋Y(jié)果，推測(cè)地稔水提液紫外光譜的吸光度可能與其抗氧化活性具有相關(guān)性。鑒于此，本研究通過探索地稔水提液紫外光譜與抗氧化活性的相關(guān)性，建立了基于紫外光譜的地稔水提液抗氧化活性快速預(yù)測(cè)方法。為了增加模型在不同紫外光譜儀間的適用性，本方法可選擇性采用無水乙醇200 nm 的吸光度進(jìn)行校正[11]。采用本方法，抗氧化活性預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的Rcal、RMSEE、RMSEcv 分別為0.887、2.20%、2.17%，Rval、RMSEP 分別為0.868、2.08%，平均預(yù)測(cè)回收率為（100.1±2.3）%，可為地稔水提液抗氧化活性的快速預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

本方法簡(jiǎn)單、綠色，無需掌握復(fù)雜的回歸參數(shù)和手動(dòng)計(jì)算方法，也不需要耗費(fèi)有機(jī)試劑，只需將待測(cè)地稔水提液用去離子水稀釋后，采集并存儲(chǔ)200～290 nm 的紫外光譜，通過所開發(fā)的應(yīng)用軟件即可快速得到抗氧化活性的預(yù)測(cè)結(jié)果。本方法分析時(shí)間較短（每采集一張紫外光譜的時(shí)間小于1 min，軟件預(yù)測(cè)時(shí)間小于2 s），而采用常規(guī)方法或在線色譜法測(cè)定DPPH 自由基清除率至少需30 min。本研究可為進(jìn)一步完善地稔的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。