吳建輝，何貝軒，賈鑫磊，郭美麗（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 3501；.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 00433）

藥用植物中的次生代謝物是中藥藥效物質(zhì)的主要來(lái)源，已知的植物次生代謝物生物合成途徑有乙酸-丙二酸途徑、異戊二烯途徑、莽草酸途徑等[1]，探究植物生物合成的調(diào)控因素不僅能提升藥材的品質(zhì)，也為中藥有效成分體外合成的工業(yè)化提供可能。

植物晝夜節(jié)律鐘是植物體內(nèi)應(yīng)對(duì)光照、溫度等外界因素隨晝夜節(jié)律性改變而進(jìn)化出的一套適應(yīng)機(jī)制[2]，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有不可或缺的作用。大量研究表明，如黃酮類化合物合成的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，也具有明顯的晝夜節(jié)律性特點(diǎn)，受晝夜節(jié)律鐘調(diào)控[3-4]。晝夜節(jié)律鐘的核心部分中央振蕩器是MYB 蛋白LHY（late elongated hypocotyl）、CCA1（circadian clock associated 1）和偽應(yīng)答調(diào)控蛋白家族（PRRs，pseudo-response regulators）組成，對(duì)維持植物晝夜節(jié)律的穩(wěn)定至關(guān)重要[5-6]。

PRRs 基因都帶有2 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，氨基端的響應(yīng)接受結(jié)構(gòu)域（receiver-like domain，RLD），其結(jié)構(gòu)上與磷酸接受域相似，羧基端帶有的CCT（Constans/Constans-like/TOC1）結(jié)構(gòu)域，這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域被一個(gè)保守程度不高的“可變域”所分隔[7-9]。目前研究發(fā)現(xiàn)在CO、CO-like 以及TOC1 基因中也有帶此類結(jié)構(gòu)域，對(duì)于植物開花進(jìn)程有著重要作用[10-11]。

研究表明PRRs 家族基因具有增加植物抗逆性，影響植物生物量的積累[12-14]，以及調(diào)控花發(fā)育及衰老等作用[15]。目前對(duì)模式植物中PRRs 基因的研究較多，如在擬南芥以及水稻中的PRRs 基因證明具有調(diào)控開花周期的作用[17]，但藥用植物中PRRs 基因的研究則罕見報(bào)道。

中藥紅花（Carthami flos）是菊科植物紅花（CarthamustinctoriusL.）的干燥花，有活血化瘀的功效。研究表明，紅花主要藥效物質(zhì)為黃酮類化合物，如羥基紅花黃色素A(HSYA)、紅花素、槲皮素、山奈酚、野黃芩苷[18]等，目前已有對(duì)紅花黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵基因查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等多種研究[19-20]，但調(diào)控紅花中黃酮類化合物生物合成途徑的基因未完全明確。驗(yàn)證晝夜節(jié)律鐘調(diào)控紅花中黃酮類化合物的生物合成對(duì)提升紅花品質(zhì)意義重大。

本研究依據(jù)前期紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因注釋篩選晝夜節(jié)律相關(guān)基因，并與紅花黃酮類化合物的積累量進(jìn)行相關(guān)分析，得到具有調(diào)控紅花黃酮類化合物生物合成功能的晝夜節(jié)律基因，通過(guò)qPCR、液質(zhì)聯(lián)用(UHPLC-MS)等方法以期闡釋PRRs 基因的特征與功能，為進(jìn)一步研究晝夜節(jié)律鐘調(diào)控紅花黃酮類化合物的生物合成積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物材料：云南巍山紅花品系（編號(hào)ZHH0119），種植于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院溫室，溫室條件：恒溫25 ℃，晝夜節(jié)律為16 h 光照/8 h 黑暗。儀器與試劑：熒光qPCR 儀：ABI7500；Phanta Max Master Mix 高保真酶，Trans Top green qPCR super mix，Trans one-step cDNA synthesis super mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金公司)；Meitler Toledo 電子天平（十萬(wàn)分之一量程）；高效液相色譜儀：Agilent1290 Infinty LC system;質(zhì)譜儀：Agilent 6 538 Accurate Mass。

1.2 紅花總RNA 的提取與cDNA 第一鏈的合成

取用新鮮紅花的花冠，根、莖、葉約100 mg 研磨成粉。依據(jù)Plant Zol 說(shuō)明書提取總RNA，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度與質(zhì)量，樣品的A260/A280在1.9～2.1 之內(nèi)可認(rèn)為符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將其作為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 紅花PRRs 基因的篩選與克隆

基于紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合基因注釋篩選出晝夜節(jié)律相關(guān)基因，通過(guò)紅花花冠表達(dá)譜獲取表達(dá)量，與紅花代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中不同花期黃酮類化合物的積累量進(jìn)行Pearson 分析，獲取與黃酮類化合物積累量相關(guān)系數(shù)r≥0.7 的晝夜節(jié)律基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行克隆。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，回收含有目的條帶的凝膠，連接載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，LBA 平板培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 全長(zhǎng)克隆引物

1.4 紅花PRR1 生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站用BLAST 在線分析紅花PRR1全長(zhǎng)序列以及編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以及同源性分析；在ExPASy 在線工具SOMPA 得出所編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征；通過(guò)Swiss-Model 同源建模預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；在ClustalX 2.1 軟件對(duì)其編碼蛋白的氨基酸序列與同源蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析；使用相鄰節(jié)點(diǎn)算法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展分析法（Bootstrap analysis）進(jìn)行1 000 次重復(fù)驗(yàn)證進(jìn)化樹可靠性。

1.5 紅花PRR1 基因表達(dá)分布特征分析

以紅花根、莖、葉、花4 個(gè)部位；花冠開花前3 d（Ⅰ期）、開花1 d（Ⅱ期）、開花3 d（Ⅲ期）、開花5 d（Ⅳ期）4 個(gè)時(shí)期[12]以及1 d 中8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00、0:00、3:00）的花冠第一鏈cDNA 為模板，設(shè)計(jì)RT-qPCR 引物，以Ct60s（KJ634810）作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.6 紅花中黃酮類化合物含量測(cè)定

取紅花Ⅲ期單日內(nèi)4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（9:00、12:00、15:00、21:00）的花冠烘干至恒重，精密稱取5.00 mg置1.5 ml 離心管，再加入精密量取的1 ml 60%甲醇，室溫放置12 h 后超聲處理40 min，12 000 r/min，10 min離心取上清液，UHPLC-MS 在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)（表2），參比離子：正離子模式為121.050 9，922.009 8；負(fù)離子模式為119.036 3，966.000 7，數(shù)據(jù)采集與分析使用Agilent MassHunter Analysis4.0軟件。以柚皮素、芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、紅花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黃芩素為對(duì)照品。

表2 UHPLC-MS 分析方法

1.7 紅花PRR1 蛋白互作體系研究

1.7.1 紅花PRR1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CtPRR1 基因進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，可信區(qū)間設(shè)置為0.4。利用Python下的networkX 將互作基因進(jìn)行可視化。

1.7.2 紅花酵母雙雜cDNA 文庫(kù)構(gòu)建

將紅花cDNA 均一化處理得到紅花酵母雙雜cDNA 文庫(kù)，與載體PGADT7 進(jìn)行同源克隆，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布LBA 平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR 驗(yàn)證

1.7.3 紅花PRR1 載體構(gòu)建與酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)PRR1 ORF 設(shè)計(jì)同源引物引入BamHI、XhoI 酶切位點(diǎn)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，連接酶切載體pGBKT7 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證后完成pGBKT7-PRR1 bait 載體的構(gòu)建。

將pGBKT7-PRR1bait 質(zhì)粒通過(guò)PEG/LiAc 法轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD 平板，28 ℃培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR 鑒定。將陽(yáng)性單克隆酵母菌液劃線涂布含有X-α-gal 和Aba 的平板。

1.7.4 酵母雙雜文庫(kù)篩選紅花PRR1 互作蛋白

將酵母感受態(tài)細(xì)胞、載體DNA、紅花酵母雙雜cDNA 文庫(kù)質(zhì)粒按共轉(zhuǎn)法混合處理后均勻涂布于SD/-His/-Trp/-Ura 三缺平板培養(yǎng)，挑取單克隆轉(zhuǎn)移至含有X-α-gal 的SD/-His/-Trp/-Ura 培養(yǎng)基，擴(kuò)增陽(yáng)性質(zhì)粒用于測(cè)序以及酵母雙雜驗(yàn)證。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS19.0 軟件處理，計(jì)量資料統(tǒng)一表示為（），組間比較采用ANOVA 分析，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅花晝夜節(jié)律相關(guān)基因的篩選

基于紅花花冠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基因注釋，檢索出PRR1、PRR2、ELF3、FT、PHYB、GI、ZTL7 個(gè)晝夜節(jié)律基因，將其在花冠不同時(shí)期的表達(dá)量與紅花代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中柚皮素、HYSA、苯丙氨酸、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素、槲皮苷、野黃芩素、槲皮素-3-葡萄糖苷7 個(gè)化合物含量進(jìn)行PEARSON相關(guān)性分析，如圖1 所示，PRR1 與紅花中主要黃酮類成分的積累量具有良好的相關(guān)性（r≥0.7）。

圖1 紅花晝夜節(jié)律基因與黃酮類物質(zhì)相關(guān)性熱圖

2.2 紅花PRR1 基因全長(zhǎng)克隆與生物信息學(xué)分析

在紅花全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的PRR1 基因全長(zhǎng)序列3 201 bp，ORF FINDER 結(jié)果顯示開放閱讀框1 549～2 814 bp，編碼421 個(gè)氨基酸，命名為CtPRR1（GenBank 登錄號(hào)：MW492035），將全長(zhǎng)序列進(jìn)行BLAST，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析如圖2A，CtPRR1 氨基酸序列與水稻（Oryzasativa L.）OsPRR73氨基酸序列（A2XFB7.2）同源性最高。Prot-param分析PRR1 基因所編碼的蛋白質(zhì)分子式C1900H3039N611O653S15，分子量為45 300，理論pI=8.52，對(duì)PRR蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖2B，Prot Scale 分析表明預(yù)測(cè)PRR1 蛋白為親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽屬非分泌蛋白；蛋白跨膜性分析預(yù)測(cè)PRR 不含有跨膜區(qū)域，為非跨膜蛋白。

圖2 CtPRR1 生物信息學(xué)分析

2.3 CtPRR1 基因在紅花中的表達(dá)特征

qPCR 結(jié)果表明（圖3A）在紅花不同部位中，CtPRR1 基因在花中的表達(dá)量最高，且與根、莖、葉都有顯著性差異(P<0.05)，對(duì)紅花花冠Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的CtPRR1 基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，CtPRR1 在Ⅰ期花冠中表達(dá)含量最低；Ⅱ期表達(dá)水平略有上升，與Ⅰ期無(wú)顯著性差異；Ⅲ期花冠中表達(dá)量明顯上升，相比Ⅰ，Ⅱ期具有顯著性差異，Ⅳ期花冠中的CtPRR1 基因表達(dá)水平略微下降（圖3B），表明CtPRR1 基因在Ⅲ期花冠中轉(zhuǎn)錄水平最高，CtPRR1 在不同時(shí)間表達(dá)量的變化與紅花黃酮類化合物積累量的變化相符[22]。對(duì)紅花8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的花冠CtPRR1 表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)CtPRR1 表達(dá)量在日間6:00 至18:00 逐漸升高，18:00 達(dá)峰值，晚間21:00至2:00 逐漸下降，3:00 最低，表達(dá)水平在白天與夜晚兩個(gè)連續(xù)的時(shí)間周期內(nèi)呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性(圖3C)。

圖3 CtPRR1 不同部位及不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量

2.4 紅花中黃酮類化合物含量測(cè)定

UHPLC-MS 檢測(cè)黃酮類化合物在單日內(nèi)不同時(shí)間的含量變化（圖4），除柚皮素外的7 個(gè)化合物在白天含量逐漸降低，而在晚間含量又升至較高的水平，柚皮素則相反在白天升高，晚間下降，但8 個(gè)化合物含量變化也呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性，與同時(shí)間點(diǎn)CtPRR1 的表達(dá)量進(jìn)行PEARSON 分析得到紅花素（r＝?0.948 5）、山奈酚（r＝?0.942 3）、野黃芩苷（r＝?0.950 4）、HSYA（r＝?0.837 2）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（r＝?0.879 2）、柚皮素（r＝0.741 5）、芹菜素（r＝?0.665 2）、槲皮素（r＝?0.487 6），目前研究認(rèn)為柚皮素在紅花黃酮類化合物生物合成途徑的上游[20]，而CtPRR1 與柚皮素呈正相關(guān)，與其他化合物呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明CtPRR1 對(duì)整體黃酮類化合物生物合成具有負(fù)調(diào)控作用而導(dǎo)致柚皮素的積累量增多，進(jìn)一步說(shuō)明CtPRR1 參與調(diào)控紅花黃酮類化合物的合成。

圖4 單日內(nèi)不同時(shí)間紅花花冠黃酮類物質(zhì)含量

2.5 CtPRR1 蛋白互作研究

STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中CtPRR1 的互作蛋白，獲得互作蛋白TOC1、PIF3、COP1、ZTL、LHY、ELF4、ELF3、CCA1、GI、PRR5、GRP7、TIC、FKF1、RVE114 個(gè)，互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)如圖5。與PRRs 基因共同參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控植物次生代謝途徑。由此獲得了較為完善的紅花晝夜節(jié)律核心元件系統(tǒng)，為進(jìn)一步探索晝夜節(jié)律調(diào)控紅花次生代謝的分子機(jī)制提供了依據(jù)。

圖5 CtPRR1 互作蛋白網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

通過(guò)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入pGBKT7-PRR bait 質(zhì)粒的酵母細(xì)胞在28 ℃生長(zhǎng)4 d 后情況正常。帶有pGBKT7-PRR bait 載體的酵母細(xì)胞與構(gòu)建的紅花cDNA 文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)后，28 ℃培養(yǎng)2 d后可以觀察到藍(lán)色菌斑出現(xiàn)，4 d 后出現(xiàn)直徑約2 mm 的藍(lán)色單克隆菌斑（圖6），菌液PCR 鑒定為陽(yáng)性克隆。結(jié)果如表3 所示，有2 個(gè)熱休克蛋白，3 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子，熱休克蛋白具有增強(qiáng)植物抗逆性的功能，AP2 轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)控體內(nèi)次生代謝。

表3 酵母雙雜篩選互作蛋白

圖6 酵母雙雜結(jié)果

3 討論

紅花作為常用的活血化瘀中藥，對(duì)其主要藥效物質(zhì)黃酮類化合物的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制的研究越來(lái)越多[20]，但目前紅花黃酮類化合物生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制仍未闡明。

本研究首次克隆了一個(gè)PRRs 家族基因CtPRR1，生物信息學(xué)分析表明其與水稻、擬南芥等其他物種中的PRRs 家族基因序列高度相關(guān)，說(shuō)明紅花中的PRRs 基因具有高度保守性。CtPRR1 基因主要在花中表達(dá)且開花后第3 天時(shí)表達(dá)量最高，與紅花不同花期黃酮類化合物的累積規(guī)律一致，存在顯著相關(guān)。我們認(rèn)為，CtPRR1 調(diào)控了紅花黃酮類化合物的生物合成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，CtPRR1 的單日表達(dá)量在日間逐漸升高，晚間逐漸下降；隨著CtPRR1 在單日表達(dá)量的升高，芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、紅花素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黃芩素積累量為白天逐漸降低，晚間逐漸升高。CtPRR1 對(duì)紅花這些黃酮類成分的晝夜節(jié)律性積累積起負(fù)調(diào)節(jié)作用；唯CtPRR1 與柚皮素的積累量呈正相關(guān)，可能與柚皮素處于黃酮生物合成途徑的較上游以及參與其他代謝過(guò)程并受到其他調(diào)控基因的影響有關(guān)。

PRRs 與CCA1、LHY 基因作為晝夜節(jié)律系統(tǒng)中的核心元件，對(duì)多種植物的晝夜節(jié)律鐘輸出途徑中與黃酮合成結(jié)構(gòu)酶基因具有相互作用[22-23]，本研究發(fā)現(xiàn)紅花CtPRR1 可能受2 個(gè)熱休克蛋白，3 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子的影響對(duì)黃酮化合物的積累起負(fù)調(diào)節(jié)作用，豐富了晝夜節(jié)律基因調(diào)控黃酮類化合物機(jī)制的研究資料。

本研究結(jié)果為深入研究紅花晝夜節(jié)律基因?qū)S酮生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制提供了資料。下一步的工作，我們將采用基因過(guò)表達(dá)以及基因敲除技術(shù)結(jié)合代謝物分析，進(jìn)一步驗(yàn)證CtPRR1 調(diào)控紅花黃酮類化合物生物合成的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為闡明CtPRR1 的功能提供重要依據(jù)。