羅二華，雷鵬，李雅文，陳婷婷，龔佳莉，匡青芬

1.博雅生物制藥集團(tuán)股份有限公司，江西 撫州344000；

2.江西省血液制品工程研究中心，江西 撫州344000；

3.江西省血液制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西撫州344000

人免疫球蛋白在臨床上主要用于原發(fā)性、繼發(fā) 性以及自身免疫性疾病（如川崎病、血小板缺乏性紫癜等）的治療，雖然被公認(rèn)為臨床使用最安全的血液制品之一，但隨著其使用范圍的不斷擴(kuò)大，臨床應(yīng)用安全性也越來越受到關(guān)注［1-2］。大量使用靜注人免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）易引起過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為皮膚潮紅、水腫、呼吸急促、血壓下降、發(fā)熱等。發(fā)生反應(yīng)的主要原因是非IgG免疫球蛋白（IgA、IgM）、人血白蛋白、多聚體等雜蛋白的存在，因此有必要最大限度地提高IgG純度。

自“二戰(zhàn)”時美國科學(xué)家Cohn等運(yùn)用適合規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的低溫乙醇法從人血漿中大量分離出免疫球蛋白制品以來，為了獲得安全性、耐受性好的IVIG，國內(nèi)外研究者針對IVIG的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了大量的研究工作。截至21世紀(jì)，研究人員又相繼開發(fā)了一些新的制備方法，用這些制備方法制備的IVIG又可稱為第4代IVIG，新的方法包括辛酸鹽-層析法、辛酸鹽-PEG-層析法、改良的低溫乙醇-層析法［3］。1960年，CHANUTIN等［4］首先報(bào)道短鏈脂肪酸（C6-C12）能與α和β球蛋白形成不溶性復(fù)合物使其沉淀，而γ球蛋白不易沉淀，從而可達(dá)到分離純化IgG目的。隨后，1969年STEINBUCH等［5］也報(bào)道了用辛酸作為沉淀劑純化IgG時，辛酸濃度、反應(yīng)pH、離子強(qiáng)度和稀釋因子與獲得的IgG純度和得率有關(guān)。HABEEB等［6］在1984年用辛酸鹽作為沉淀劑沉淀血漿中的非IgG成分，然后用DEAE-纖維素柱層析對含有IgG粗品的上清進(jìn)行純化，以血漿為起始原料，IgG的得率可達(dá)78%～87%。LEBING等［7］和TREJO等［8］在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了IgG純化工藝，他們用組分Ⅱ+Ⅲ溶解液代替血漿作為起始原料，通過2次辛酸鹽沉淀結(jié)合陰離子交換層析分離IVIG，發(fā)現(xiàn)辛酸鹽在沉淀非IgG成分（組分Ⅲ）時，有滅活病毒的作用，IgG得率可達(dá)69%。目前國外已上市產(chǎn)品“Gamimune?N，10%”，即通過辛酸鹽沉淀結(jié)合陰離子交換層析制備獲得［9］。相比于其他制備工藝，第4代IVIG制備工藝具有生產(chǎn)周期短、IgG得率高、制品安全性高的特點(diǎn)。

本研究以組分Ⅱ+Ⅲ沉淀為原料，對辛酸沉淀工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合后續(xù)兩步層析法評價(jià)10%IVIG中雜蛋白的去除效果。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 組分Ⅱ+Ⅲ沉淀購自博雅生物制藥集團(tuán)股份有限公司；人血白蛋白測定試劑盒（153946B）、IgG測定試劑盒（153067P）購自德國西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司；IgA測定試劑盒（321-486）、IgM測定試劑盒（322476）購自美國ZeptoMetrix公司；冰醋酸、氫氧化鈉、辛酸鈉、醋酸鈉購自成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司；AM90L-H攪拌機(jī)購自上海昂尼儀器儀表有限公司；QL-866混懸儀購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Evolution201紫外可見分光光度計(jì)、Multiskan FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；BNProSpec全自動蛋白分析儀購自德國西門子股份公司；pH計(jì)購自上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；AKTApurifier100層析系統(tǒng)、層析柱（XK26／70）、CaptoQ填料、Capto QXP填料購自美國GE公司。

1.2辛酸沉淀工藝參數(shù)的優(yōu)化 為提高組分Ⅱ+Ⅲ沉淀的綜合利用水平，在查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，以組分Ⅱ+Ⅲ為起始原料，并認(rèn)為影響辛酸沉淀工藝的因素主要為溶解倍數(shù)、反應(yīng)液終pH值、辛酸鈉濃度［10-11］。本文采用L9（33）因素水平對溶解倍數(shù)（A）、反應(yīng)液終pH值（B）、辛酸鈉濃度（C）3個因素進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)1個3因素3水平的正交試驗(yàn)方案，見表1。

表1 辛酸沉淀工藝正交設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Factors and levels in orthogonal design for caprylic acid precipitation process

取組分Ⅱ+Ⅲ沉淀，分為9個實(shí)驗(yàn)組。每組取100 g沉淀，用相應(yīng)量的2～8℃注射用水于攪拌機(jī)內(nèi)攪拌溶解，溶解后用2 mol／L醋酸調(diào)節(jié)pH為4.1左右，控制反應(yīng)液溫度為2～8℃，再攪拌約2 h；滴加0.5 mol／L NaOH調(diào)節(jié)懸浮pH為4.4左右，加入10%辛酸鈉至辛酸鈉終濃度達(dá)表1要求，再調(diào)節(jié)反應(yīng)液終pH至設(shè)計(jì)要求，攪拌2 h；過濾收集上清，過濾液進(jìn)行IgG、IgA、IgM、人血白蛋白（albumin，Alb）、純度檢測，計(jì)算IgG總量和IgG回收率。

1.3兩步層析工藝 取100 g組分Ⅱ+Ⅲ沉淀，按最佳工藝參數(shù)進(jìn)行辛酸沉淀后，過濾收集上清，進(jìn)行Q、QXP兩步層析純化。層析前用pH 5.4 0.01 mol／L醋酸鈉溶液平衡柱。兩步層析純化均采取流穿模式，即收集流穿液進(jìn)行IgG、IgA、IgM、Alb、純度檢測，計(jì)算IgG總量和IgG回收率，評價(jià)雜蛋白去除效果。

1.4IgG、A l b含量的檢測 采用散色比濁法［12］。供試品中的蛋白可與特異性抗體形成免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物會使穿過樣本的光束發(fā)生散射。散射光的強(qiáng)度與樣本中相關(guān)蛋白的濃度成正比，與已知標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行對比即可獲得結(jié)果。1.5Ig A、Ig M含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法［13］。供試品中的IgA／IgM與微板上的IgA／IgM抗體結(jié)合，被結(jié)合的IgA／IgM再與帶辣根過氧物酶的IgA／IgM抗體結(jié)合，這種酶可與底物四甲基聯(lián)苯胺發(fā)生反應(yīng)，在450 nm波長下，樣品中IgA／IgM的含量與A值成正比。

1.6純度檢測 按照《中國藥典》三部（2020版）通則0541第二法，醋酸纖維素薄膜電泳法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1辛酸沉淀工藝最佳參數(shù) 不同組別辛酸沉淀工藝參數(shù)初純后，仍有IgA、IgM、Alb雜蛋白的殘余，這與辛酸鈉非特異性沉淀的特性有關(guān)，通過辛酸鈉沉淀法初純無法達(dá)到完全純化IgG的目的?？紤]到完全純化尚需依賴后續(xù)兩步層析工藝，要求過高的純度并無意義。因此選擇IgG總量和IgG回收率最高的工藝參數(shù)，極差順序?yàn)镽C＞RB＞RA，即辛酸沉淀工藝對IgG總量的影響順序?yàn)樾了徕c濃度＞反應(yīng)液終pH＞溶解倍數(shù)。見表2。綜上，我們認(rèn)為辛酸沉淀工藝最佳工藝參數(shù)為5號實(shí)驗(yàn)組：溶解倍數(shù)13倍，反應(yīng)液終pH 5.1，反應(yīng)液辛酸鈉終濃度20 mmol／L。

表2 辛酸沉淀工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.2 Orthogonal design results of caprylic acid precipitation process

2.2兩步層析后雜蛋白去除效果 經(jīng)Q層析主要去除了殘余Alb，部分去除IgA和IgM，且IgG未見明顯損失；經(jīng)QXP層析IgA和IgM均已去除至1 mg／L以下。見表3。表明通過辛酸沉淀結(jié)合兩步層析純化，可獲得高純度IgG。

表3 兩步層析純化對IgA、IgM、Alb去除效果的影響（x±s，n=9）Tab.3 Effect of two-step chromatography on removal of IgA，IgM and ALB（x±s，n=9）

3 討論

國內(nèi)企業(yè)提取人免疫球蛋白時，普遍采用低溫乙醇法，即通過調(diào)節(jié)pH、乙醇濃度、溫度、離子強(qiáng)度、蛋白濃度等步驟分離純化。低溫乙醇法生產(chǎn)步驟繁瑣，得率在50%左右，且最后制品中IgA、IgM等雜蛋白很難除盡。2020年12月1日實(shí)施的《中國藥典》三部（2020版），將IgA含量新納入IVIG質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，從法規(guī)層面進(jìn)一步要求提高制品安全性［14］。

本研究涉及的第4代提取工藝中的辛酸沉淀-層析工藝，可最大限度提取血漿組分中IgG，去除殘留IgA、IgG、Alb等雜蛋白，在提高噸收得率的同時，確保產(chǎn)品質(zhì)量安全有效。

組分Ⅱ+Ⅲ沉淀中含有大量γ球蛋白（主要為IgG、IgA、IgM），同時還含有α2和β球蛋白。辛酸是一種天然存在的C8飽和脂肪酸［11，15］，其辛基基團(tuán)部分有助于其與α和β球蛋白形成不溶性復(fù)合物使其沉淀，而γ球蛋白不易沉淀，從而達(dá)到分離純化的目的。本研究結(jié)果顯示，采用最佳辛酸沉淀工藝，IgG回收率可達(dá)78.1%，純度＞80%。Q層析主要去除了Alb、α球蛋白和β球蛋白等殘余蛋白，IgA和IgM也有一定程度降低，IgG回收率＞96%損失較少，純度有部分提高。QXP層析可去除IgA、IgM至痕量，部分去除IgG多聚體及IgG二聚體，IgG純度明顯提高，但I(xiàn)gG回收率＜85%，有較大提升空間。下一步可通過調(diào)整QXP層析工藝條件，進(jìn)一步提高回收率。

本研究為最大化提取人免疫球蛋白，優(yōu)選辛酸沉淀工藝所能提取IgG總量最高的工藝參數(shù)，優(yōu)選的參數(shù)為溶解倍數(shù)的13倍，反應(yīng)液終pH為5.1，反應(yīng)液辛酸鈉終濃度為20 mmol／L。優(yōu)選的辛酸沉淀后上清經(jīng)Q、QXP兩步層析純化后純度達(dá)99.99%，IgA、IgM、Alb含量下降至1 mg／L以下。通過IgG辛酸沉淀工藝參數(shù)優(yōu)選，確定了辛酸沉淀最佳工藝參數(shù)，可最大限度提取IgG，提升產(chǎn)品收率，給合兩步層析純化，可獲得高純度IgG，該工藝可用于臨床安全的人免疫球蛋白產(chǎn)品開發(fā)。

本研究僅涉及IgG提純步驟，層析獲得流穿液后，尚需進(jìn)行超濾、除菌、病毒滅活等步驟以獲得最終制劑。有研究表明，辛酸具有滅活脂包膜病毒的作用［16］。下一步，我們還需進(jìn)行病毒滅活工藝研究，尤其是小孔徑納濾工藝的優(yōu)化，以獲得安全性高的制劑。