吳浪,陳升鑫,張貫軍,張大涯,陳德鑫,李明陽(yáng)

【提要】目的 急性胰腺炎是消化系統(tǒng)常見的急腹癥，患病率高，治療方法有限，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。本研究的目的是確定急性胰腺炎發(fā)病中可靠的差異表達(dá)基因和潛在的致病機(jī)制，豐富急性胰腺炎的研究，為未來(lái)在治療上提供更多的參考價(jià)值和依據(jù)。方法 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得高通量數(shù)據(jù)集GSE194331和GSE109227的全基因組表達(dá)譜，找出表達(dá)值高且存在共表達(dá)的差異表達(dá)基因，再對(duì)這些基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選出存在關(guān)聯(lián)的50個(gè)基因，進(jìn)一步對(duì)這些基因進(jìn)行基因本體和KEGG通路富集分析。接下來(lái)，從中挑出一個(gè)目標(biāo)基因NMI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先，收取急性胰腺炎患者的血液樣本驗(yàn)證NMI的激活。然后，用雨蛙素對(duì)野生小鼠造急性胰腺炎模型驗(yàn)證NMI的活化。最后，通過(guò)NMI基因敲除小鼠驗(yàn)證NF-κB信號(hào)通路。結(jié)果 從數(shù)據(jù)集中篩查出246個(gè)共表達(dá)的差異基因，其中50個(gè)基因在蛋白互作網(wǎng)中存在著關(guān)聯(lián)性，基因富集分析表明這些基因主要參與了NF-κB、TLR和MAP多條信號(hào)傳導(dǎo)通路。實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了從中挑選出的NMI基因在急性胰腺炎患者和野生鼠的胰腺炎模型中激活，并且NMI基因敲除后，小鼠胰腺組織的NF-κB/p65的基礎(chǔ)表達(dá)水平明顯降低，磷酸化NF-κB/p65在NMI KO胰腺炎組小鼠中活化水平明顯低于野生胰腺炎組。NMI KO胰腺炎組中胰腺腺泡的損傷程度比野生胰腺炎組低。結(jié)論 NMI可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)急性胰腺炎的損傷過(guò)程。

急性胰腺炎是消化系統(tǒng)一種常見得到急腹癥，它是胰酶激活引起自身組織消化而導(dǎo)致的內(nèi)源化學(xué)性炎癥反應(yīng)。膽結(jié)石和高脂血癥是急性胰腺炎的兩大病因，酗酒和暴飲暴食被公認(rèn)為最常見的誘因[1-3]。盡管大多數(shù)急性胰腺炎表現(xiàn)為輕癥，但病情進(jìn)展時(shí)可累及全身臟器衰竭，發(fā)展為重癥急性胰腺炎，死亡率可高達(dá)50%以上，占胰腺炎總死亡率的2%～5%[4]，在臨床上主要以對(duì)癥支持治療為主，尚無(wú)特效藥物控制病情。雖然有不少關(guān)于急性胰腺炎藥物及治療方面的研究，Parabacteroides[5]、Isoliquiritigenin[6]、Wedelolactone[7]和西格列汀[8]等均能減輕急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)，但其臨床療效并未得到驗(yàn)證。

大量的科研成果證實(shí)了急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制與基因的多態(tài)性有關(guān)，如PRSS1[9]，DPPIV[10]，TPH1[11]等。并且研究表明多條信號(hào)通路參與了急性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程，p62-Keap1-Nrf2[8],JAK2/STAT3[12],JNK[13],NF-κB[14]和p38/MAPK[15]等通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮著不可替代的作用。最新證據(jù)揭示鐵死亡和細(xì)胞焦亡也參與了急性胰腺炎的致病機(jī)制[7, 16]。然而，大部分研究是在動(dòng)物誘導(dǎo)模型的背景下模擬進(jìn)行的，如雨蛙素[9]、脂多糖[17]、?；鞘懰崃蛩猁}[18]等誘導(dǎo)小鼠急性胰腺炎模型，其機(jī)制研究到底有多少是與人類急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制是一致的，我們不得而知。

在本研究中，我們應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，以基于來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)的高通量測(cè)序結(jié)果，綜合分析了人類和小鼠急性胰腺炎模型的全基因組測(cè)序的共同差異基因表達(dá)和信號(hào)通路分析，并篩選其中一個(gè)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，闡明相關(guān)基因在急性胰腺炎中的致病機(jī)制，希望未來(lái)為靶向藥物的研究提供新的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集和處理

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一個(gè)注釋非常豐富的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，我們從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出GSE194331和GSE109227數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集GSE194331基于平臺(tái)GPL16791(Illumina HiSeq 2500),包括32名健康對(duì)照組，57名輕癥急性胰腺炎，20名中重癥急性胰腺炎，10名重癥急性胰腺炎患者。從中獲得了急性胰腺炎外周血的RNA-Seq數(shù)據(jù)，包括矩陣文件數(shù)據(jù)和補(bǔ)充文件數(shù)據(jù)。然后根據(jù)樣本編號(hào)、疾病編號(hào)和基因表達(dá)情況逐一進(jìn)行核對(duì)，以確保個(gè)體中的基因表達(dá)譜對(duì)應(yīng)正確的患者。在這項(xiàng)研究中，我們選擇了輕癥急性胰腺炎的樣本數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集GSE109227基于平臺(tái)GPL6246(Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array)，包括5只注射氯化鈉的野生型小鼠作為對(duì)照，5只腹腔注射雨蛙素誘導(dǎo)急性胰腺炎的小鼠胰腺作為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因的識(shí)別

數(shù)據(jù)集GSE194331和GSE109227的原始數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載，GSE194331通過(guò)R包進(jìn)行處理,先對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換，并去掉缺失值，選出平均值大于100的基因。GSE109227數(shù)據(jù)集通過(guò)GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE109227)進(jìn)一步處理。兩個(gè)數(shù)據(jù)集均進(jìn)行質(zhì)量歸一化，|log2倍數(shù)變化 (log2FC)|>log21.5和P<0.05被設(shè)置為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。用R包繪制韋恩圖。

1.3 差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING[19]在線工具(https://cn.string-db.org/)是用于檢索相互作用基因的搜索工具，它可以用來(lái)探索差異基因編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系以及差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合得分>0.7且節(jié)點(diǎn)之間存在著關(guān)聯(lián)被認(rèn)為是有意義的，并被映射到網(wǎng)絡(luò)中。接下來(lái)，用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)存在著關(guān)聯(lián)的基因用R包繪制熱圖。

1.4 功能富集分析

DAVID[20]數(shù)據(jù)庫(kù) (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)是一個(gè)集注釋、可視化和集成在線工具，它為科研人員提供了全面的注釋信息以了解基因的背后的生物學(xué)意義。在該研究中，我們引入了DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已識(shí)別基因的功能注釋和通路分析，選擇P值<0.05且FDR<0.05作為富集項(xiàng)閾值，獲取了基因本體和京都基因與基因組百科全書通路中的差異基因富集結(jié)果。用R包作圖可視化分析。

1.5 試劑和材料

酶聯(lián)免疫試劑盒人源NMI、小鼠NMI和小鼠IL-18從華美(武漢，中國(guó))獲得，酶聯(lián)免疫試劑盒小鼠IL-18和IL-1β購(gòu)買于R&D system (Minneapolis, MN, 美國(guó))，IL-雨蛙素來(lái)自于MedChemExpress (New Jersey, 美國(guó))。NF-κB p65抗體從Abcam(Cambridge, MA, 美國(guó))購(gòu)置，anti-rabbit-IgG和anti-mouse IgG從Cell Signaling (Beverly, MA, 美國(guó))購(gòu)買，GAPDH 抗體來(lái)自于TRANS (北京,中國(guó))。

1.6 人血液樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

輕癥急性胰腺炎患者(32名)的血液樣本從解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心就診的患者中采集，健康志愿者(16名)的血液樣本作為對(duì)照。靜置、4 ℃ 3 000 rpm 離心5分鐘，分離血漿并儲(chǔ)存于-80 ℃，用Elisa法檢測(cè)NMI、IL-1β和IL-18水平。知情同意書經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，S2021-612-03).

1.7 野生型小鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

從SPF (Beijing) 生物技術(shù)有限公司購(gòu)買C57BL/6種系野生小鼠，體重18～25 g，雌雄不分，所有小鼠均喂食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料和清水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)申請(qǐng)獲得了中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SQ2021299)，所有小鼠均在麻醉狀態(tài)下脫頸處死。用雙蒸水稀釋雨蛙素(濃度：10 μg/mL，pH約7.0)。將小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只：對(duì)照組(不處理)，急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小時(shí)，麻醉狀態(tài)下進(jìn)行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，將血液樣本在4 ℃ 3 000 rpm 的條件下離心5分鐘，取血漿進(jìn)行淀粉酶、脂肪酶、NMI和炎癥因子水平檢測(cè).

1.8 NMI基因敲除小鼠驗(yàn)證NF-κB信號(hào)通路

以C57BL/6種系野生小鼠為背景，進(jìn)行NMI基因整體敲除，對(duì)雌性C57BL/6超排卵后與雄性C57BL/6小鼠交配并收集輸卵管中的受精卵。將Cas9 mRNA (150 ng mL-1) 和轉(zhuǎn)錄的sgRNA (100 ng mL-1) 混合并在M2培養(yǎng)基 (Sigma，M7167, 100 mL) 中顯微注射到具有狀態(tài)良好的核仁的受精卵的細(xì)胞質(zhì)中。將小鼠分為4組，體重18～25 g，雌雄不分，每組6只：野生對(duì)照組(不處理)，NMI KO對(duì)照組(不處理)，野生急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)，NMI KO急性胰腺炎組(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小時(shí)，進(jìn)行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，將血液樣本在4 ℃ 3 000 rpm 的條件下離心5分鐘，取血漿進(jìn)行淀粉酶、脂肪酶和炎癥因子水平檢測(cè)。取每只小鼠胰腺組織，分兩份，一份置于-80℃用于提取蛋白，一份固定于多聚甲醛用于蠟片包埋。

1.9 組織蛋白質(zhì)印跡

為了評(píng)估組織中的特定蛋白質(zhì)活性，我們研磨了小鼠胰腺組織，并使用NP40提取了總蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)定容定量和變性后，用十二烷基硫酸鈉 - 聚芳酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到膜上，用脫脂牛奶封閉1 h后，檢測(cè)GAPDH和NF-κB/P65的特異性抗體。

1.10 組織病理學(xué)分析

將胰腺組織固定在4%多聚甲醛(PFA)中，包埋在石蠟中，切成5 μm片，然后用蘇木精和伊紅(HE)染色(北京瑞博科技有限公司)。在×200放大倍率的光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理改變。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的識(shí)別

從GSE194331數(shù)據(jù)集下載了119個(gè)樣本急性胰腺炎患者的RNA-Seq信息，其中輕度急性胰腺炎患者57名。對(duì)所有樣本的基因表達(dá)值用R包進(jìn)行分析。用EdgeR統(tǒng)計(jì)方法分析差異表達(dá)基因。我們使用GEO2R工具處理GSE109227數(shù)據(jù)集并進(jìn)行歸一化后，篩選出了3080個(gè)基因上調(diào)，2457個(gè)基因下調(diào)。圖1A為數(shù)據(jù)集GSE194331和GSE109227的差異表達(dá)基因的韋恩圖。其中有246個(gè)為在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中共表達(dá)的基因。接下來(lái)，使用STRING在線工具(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape軟件，將246個(gè)有差異的共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)濾到PPI網(wǎng)絡(luò)中，組合得分大于0.7，并且在Cytoscape中存在著關(guān)聯(lián)的基因包含50個(gè)節(jié)點(diǎn)，69條邊(圖1B)。一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)基因，邊代表基因之間的相互作用。 圖1C為該50個(gè)基因在數(shù)據(jù)集GSE194331的輕癥急性胰腺炎血液樣本中的表達(dá)熱圖。

圖1 從GSE194331和GSE109227高通量數(shù)據(jù)集中鑒定差異表達(dá)基因 A： GSE194331數(shù)據(jù)集急性胰腺炎血清樣本高通量測(cè)序中差異表達(dá)基因的火山圖；B：GSE109227數(shù)據(jù)集小鼠急性胰腺炎模型胰腺組織高通量測(cè)序中差異表達(dá)基因的火山圖。藍(lán)色圖表示高表達(dá)水平的基因，紅色圖表示低水平表達(dá)的基因，灰色表示沒(méi)有差異表達(dá)的基因；C： GSE194331和GSE109227數(shù)據(jù)集與轉(zhuǎn)錄因子重疊的基因的韋恩圖；D：GSE194331和GSE109227數(shù)據(jù)集與轉(zhuǎn)錄因子重疊的共同的差異表達(dá)基因的韋恩圖

2.2 通路富集分析

為了研究我們篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因的功能注釋，我們通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共表達(dá)的50個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了功能富集分析。圖2A顯示了三類GO術(shù)語(yǔ)生物過(guò)程的氣泡圖，氣泡的顏色表現(xiàn)P值，大小表示與差異基因的計(jì)數(shù)成正比。生物過(guò)程中富含差異表達(dá)基因的GO術(shù)語(yǔ)主要為炎癥反應(yīng)。圖2B顯示KEGG通路富集分析表明這些差異表達(dá)基因參與了多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括NF-κB、TLR和MAPK。

圖2 差異表達(dá)基因的功能及通路富集分析 A：生物過(guò)程；B：KEGG通路。點(diǎn)的大小代表富集的差異基因數(shù)量,顏色代表P值

2.2.1 基因NMI的急性胰腺炎患者中激活 在急性胰腺炎患者的血漿樣本中，NMI的水平顯著高于正常對(duì)照組(圖3A)，并且炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放明顯增多(圖3B)。這表明NMI在急性胰腺炎患者血液樣本中激活，并能促進(jìn)急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)。

圖3 急性胰腺炎患者中細(xì)胞因子的活化情況 A：血漿NMI激活；B：血漿IL-18和IL-1β水平

2.2.2 基因NMI的急性胰腺炎小鼠模型中激活 雨蛙素誘導(dǎo)了小鼠急性胰腺炎模型，在急性胰腺炎小鼠的血漿中，淀粉酶和脂肪酶水平明顯升高(圖4A)，這表明我們的胰腺炎造模成功。并且，NMI的表達(dá)水平顯著上升(圖4B)，炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放明顯增加(圖3C)。這與我們?cè)诩毙砸认傺谆颊哐簶颖局序?yàn)證的結(jié)果一致。

圖4 急性胰腺炎野生小鼠模型中細(xì)胞因子的釋放情況 A：血漿淀粉酶和脂肪酶水平；B：血漿NMI激活；C：血漿IL-18和IL-1β水平

2.2.3 NMI基因敲除鼠構(gòu)建 NMI基因敲除小鼠構(gòu)建使用CRISPR-Cas9技術(shù)制備，NMI的sgRNA序列是AAAACAAAGAACTAGACGAGG[21]。圖5為NMI-/-小鼠基因組的缺失和移碼突變的結(jié)果驗(yàn)證。

圖5 使用CRISPR-Cas9技術(shù)制備NMI敲除基因小鼠，顯示了NMI-/-小鼠基因組的缺失和移碼突變

2.2.4 NMI KO小鼠驗(yàn)證信號(hào)通路 NMI基因敲除降低了淀粉酶、脂肪酶和炎癥因子的基礎(chǔ)表達(dá)水平，但在急性胰腺炎的小鼠中，只有淀粉酶的水平明顯低于野生型小鼠(圖6A)，其余因子并未表現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖6B)。同時(shí)，我們?nèi)⌒∈蟮囊认俳M織勻漿提取蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)NF-κB/p65的基礎(chǔ)表達(dá)水平在NMI KO小鼠明顯降低。雖然在胰腺炎的小鼠胰腺組織中，P-NF-κB/p65出現(xiàn)明顯的活化，但NMI KO組中，P-NF-κB p65的活化明顯不如野生小鼠組(圖6C)。從胰腺的病理組織切片，我們發(fā)現(xiàn)NMI KO 小鼠的胰腺組織腺泡細(xì)胞損傷程度低于野生小鼠胰腺組織(圖6D)。這表明NMI基因敲除后，雖然不影響炎癥因子的釋放，但是NF-κB/p65的表達(dá)及激活受到了抑制，NMI可能通過(guò)NF-κB信號(hào)通路參與急性胰腺炎的炎癥過(guò)程。

圖6 與野生型小鼠相比，NMI KO小鼠細(xì)胞因子和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 A：血漿淀粉酶和脂肪酶水平；B：血漿IL-1β和IL-18 的水平；C：免疫蛋白印跡檢測(cè)NF-κB的表達(dá)情況；D：通過(guò)H&E染色確定胰腺損傷，黑色箭頭代表腺泡細(xì)胞變性，黃色箭頭代表腺泡細(xì)胞壞死，藍(lán)色箭頭代表自噬腺泡細(xì)胞 (×200)

3 討論

在這項(xiàng)研究中，我們用了人和小鼠高通量測(cè)序的信息，共鑒定出246個(gè)符合篩選條件的共同差異表達(dá)基因，50個(gè)基因存在蛋白質(zhì)互作關(guān)聯(lián)，對(duì)這些基因進(jìn)行通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)不少基因富集在NF-κB信號(hào)通路上。在我們用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證其中的NMI基因和通路時(shí)，結(jié)論與我們先前的分析不謀而合。因此，我們有理由地認(rèn)為NMI在急性胰腺炎中通過(guò)NF-κB通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)這大多數(shù)基因的表達(dá)，它在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生、炎癥和各種免疫性疾病中起著關(guān)鍵的作用。有研究表明[22]G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑和介質(zhì)β-Arrestins能夠通過(guò)抑制NF-κB p65的激活來(lái)減輕急性胰腺炎，多巴胺通過(guò)抑制NF-κB通路減輕了膽囊收縮素刺激的胰腺腺泡細(xì)胞的炎癥[23]，并且血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 (ACE)2-血管緊張素-(Ang)-(1-7)-Mas軸通過(guò)抑制p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路顯著抑制胰腺炎[24]，蟲草素也能通過(guò) AMPK 抑制NF-κB和NLRP3 炎性體激活來(lái)緩解急性胰腺炎帶來(lái)的損傷[25]。朱等人[26]的研究表明p21激活激酶 1(PAK1)在急性胰腺炎小鼠模型的胰腺中上調(diào)，從而激活NF-κB和p38通路，抑制PAK1降低NF-κB和p38的活性，減輕小鼠模型胰腺的病理?yè)p傷和炎癥因子的水平。雙鏈 RNA 依賴性激酶(PKR)促進(jìn)NF-κB 的激活和促炎因子的產(chǎn)生，它加速了急性胰腺炎中的炎癥反應(yīng)和胰腺細(xì)胞損傷[27]。lncRNA母源表達(dá)基因3(MEG3)通過(guò)介導(dǎo) HPDE 細(xì)胞中的 NF-κB 通路靶向 miR-195-5p/FGFR2 調(diào)節(jié)軸，參與雨蛙肽誘導(dǎo)的炎癥損傷[28]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲除NMI基因后，雨蛙素造模的輕癥急性胰腺炎小鼠的胰腺組織中NF-κB/p65的活化明顯受到了抑制，胰腺組織的病理?yè)p傷有所減輕，淀粉酶的釋放水平明顯減少，但血液中脂肪酶和炎癥因子的水平確沒(méi)有明顯的變化。NMI作為程序性細(xì)胞損傷應(yīng)答因子，它對(duì)急性胰腺炎的致病機(jī)制是否與病情的嚴(yán)重程度有關(guān)，值得我們進(jìn)一步探討。

綜上所述，NMI可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)急性胰腺炎的損傷過(guò)程。