李 丹，董義春，蘇富琴，徐 倩，楊大偉，劉艷華，汪 霞，梁先明

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

生物等效性(Bioequivalence，BE)指含有相同活性物質(zhì)的兩種產(chǎn)品藥學(xué)等效或藥劑學(xué)可替代，在相同條件下以相同摩爾劑量給藥，活性成分的吸收程度和速度無顯著差異。生物等效性研究的臨床意義在于確定藥品的可處方性和藥品之間的可互換性。為科學(xué)規(guī)范獸用化學(xué)藥品生物等效性研究，保障獸藥安全、有效、質(zhì)量可控，2009年農(nóng)業(yè)部第1247號公告發(fā)布《獸藥化學(xué)藥品生物等效性試驗指導(dǎo)原則》[1]，EMA于2022年1月28日實施最新的獸藥生物等效性(血藥法)指導(dǎo)原則，為緊跟國際評審發(fā)展腳步，守住“研好藥、產(chǎn)好藥、用好藥”的關(guān)鍵一環(huán)，我中心緊緊把握指導(dǎo)原則的“科學(xué)性、前瞻性和可操作性”原則，結(jié)合國內(nèi)獸藥研究現(xiàn)狀組織修訂發(fā)布《獸用化學(xué)藥品血藥濃度法生物等效性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》，并于2023年1月1日執(zhí)行。該指導(dǎo)原則主要修訂了生物等效判定標(biāo)準(zhǔn)、細(xì)化了生物樣品的定量分析方法驗證、增加了生物等效性試驗評審中常見問題(如半片給藥、嘔吐剔除等)的技術(shù)要求。另外，由于該指導(dǎo)原則僅適用于新獸藥注冊，因此參比制劑限定為原研制劑這一種情形。再者，該指導(dǎo)原則配套了試驗報告撰寫要求，對研發(fā)和評審的可參考性更強(qiáng)。該指導(dǎo)原則由概述、試驗設(shè)計、試驗報告及附錄四個部分組成，本文重點針對獸用化學(xué)藥品血藥濃度法生物等效性試驗的適用范圍、試驗設(shè)計涉及的分析方法、普通制劑的生物等效性評價、內(nèi)服緩控釋制劑、復(fù)方制劑等內(nèi)容進(jìn)行簡單闡述，旨在加強(qiáng)研發(fā)單位或相關(guān)臨床試驗機(jī)構(gòu)對此指導(dǎo)原則的理解，并對生物等效性試驗的有效開展提供指導(dǎo)和幫助。

1 適用范圍

本指導(dǎo)原則的適用范圍僅限于獸用化學(xué)藥品注冊，獸用中藥根據(jù)產(chǎn)品的具體情況可酌情參考本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則不包含難以取血的物種(如蜂、蠶)，血藥濃度無法代表作用部位藥物濃度的情形(如局部給藥發(fā)揮局部作用的制劑、乳房注入劑、子宮注入劑、靜脈特殊給藥系統(tǒng)靶位點釋放藥物)，微生物發(fā)酵產(chǎn)品，治療用蛋白或多肽，預(yù)混劑，藥效學(xué)終點的生物等效性試驗，臨床終點的生物等效性試驗。

下列產(chǎn)品可豁免血藥濃度法生物等效性試驗：靜脈、皮下或肌內(nèi)注射給藥的水性溶液；內(nèi)服溶液或其他溶解的劑型；內(nèi)服不吸收的產(chǎn)品(如抗酸劑，透視介質(zhì))；揮發(fā)性吸入麻醉溶液。

2 試驗設(shè)計

2.1 分析方法 合適、可靠的分析方法是血藥濃度法生物等效性研究的關(guān)鍵。全血、血漿、血清等生物樣品具有取樣量少，藥物濃度低，內(nèi)源性物質(zhì)(如無機(jī)鹽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、代謝物以及其他藥物)干擾多，個體差異大等特點。因此，必須根據(jù)被測物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、濃度范圍和樣品介質(zhì)等具體情況，建立適宜的生物樣品定量分析方法，并對方法進(jìn)行驗證，相關(guān)要求參見配套發(fā)布的《生物樣本定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》。方法驗證項目包括：選擇性、殘留、定量下限、標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度、稀釋可靠性、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性。在分析方法驗證后，應(yīng)根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品、質(zhì)控樣品和校正標(biāo)樣，以保證分析批被接受。值得研發(fā)單位和相關(guān)臨床試驗機(jī)構(gòu)特別注意的是，新版指導(dǎo)原則正式實施后對生物等效性試驗最主要的變化是明確了對分析批的具體要求。分析批的操作和處理是注冊申報資料中的重點審查內(nèi)容，在此簡要闡述具體試驗過程中分析批的六個關(guān)注點：(1)一個分析批應(yīng)該包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少6個濃度水平的校正標(biāo)樣，至少3個濃度水平質(zhì)控樣品(低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總數(shù)的5%，兩者中取數(shù)目更多者)，以及被分析的試驗樣品。(2)所有樣品(校正標(biāo)樣、質(zhì)控和試驗樣品)應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。一個分析批包括的樣品應(yīng)在同一時間，由同一分析者使用相同的試劑相繼處理，保持條件的一致性，而且質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個批中，以此保證整個分析批的準(zhǔn)確度和精密度。同時，應(yīng)該注意，對于生物等效性試驗，建議一個受試動物的全部樣品在同一分析批中分析，減少結(jié)果的變異。(3)在分析試驗計劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中，應(yīng)執(zhí)行下列接受標(biāo)準(zhǔn)：校正標(biāo)樣測定回收濃度一般應(yīng)在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在±20%范圍內(nèi)，不少于6個校正標(biāo)樣，至少75%標(biāo)樣應(yīng)符合這些標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度值應(yīng)該在標(biāo)示值的±15%范圍內(nèi)，至少67%質(zhì)控樣品，且每一濃度水平至少50%樣品符合這一標(biāo)準(zhǔn)。另外，在同時測定幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果一個分析批對于一個分析物可以接受，而對于另一個分析物不能接受，則接受的分析物數(shù)據(jù)可以被使用，對被拒絕的分析物應(yīng)該重新提取和分析。如果使用多重校正標(biāo)樣，其中僅一個定量下限或定量上限標(biāo)樣不合格，則校正范圍不變。在此需要特別指出的是，所有接受的分析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準(zhǔn)確度和精密度均應(yīng)該列表，并在分析報告中給出。如果總平均準(zhǔn)確度和精密度超過15%，則需要進(jìn)行額外的考察，并說明該偏差的理由。(4)在試驗樣品分析開始前，如果已知或預(yù)期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄，則推薦縮窄標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當(dāng)加入質(zhì)控樣品新的濃度，以充分反映試驗樣品的濃度。如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應(yīng)該延伸標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度，至少2個質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)。如果標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新驗證(部分驗證)，以確認(rèn)響應(yīng)函數(shù)并保證準(zhǔn)確度和精密度。(5)應(yīng)該在試驗計劃或標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗樣品的理由以及選擇報告值的標(biāo)準(zhǔn)，而且在試驗報告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)目以及所占樣品總數(shù)的比例。特別指出的是，給藥前樣品陽性結(jié)果或者由于藥動學(xué)原因進(jìn)行重新分析的情況下，資料中應(yīng)該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終接受值以及接受理由。在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進(jìn)樣的重現(xiàn)性和進(jìn)樣器內(nèi)穩(wěn)定性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進(jìn)樣。但對于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。(6)在標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中應(yīng)描述色譜的積分以及重新積分。任何對該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的偏離都應(yīng)在分析報告中討論。實驗室應(yīng)該記錄色譜積分參數(shù)，在重新積分的情況下，記錄原始和最終的積分?jǐn)?shù)據(jù)。

2.2 普通制劑的生物等效性評價

2.2.1 試驗設(shè)計 生物等效性研究一般按自身交叉對照的方法設(shè)計。首選2×2交叉設(shè)計，根據(jù)受試制劑的個數(shù)還可分別采用3×3交叉、4×4交叉或部分交叉等設(shè)計。其他設(shè)計，如序貫設(shè)計、四處理雙周期設(shè)計(受試制劑/受試制劑、參比制劑/參比制劑、受試制劑/參比制劑和參比制劑/受試制劑)或多周期設(shè)計在某些情形下也是合適的，但應(yīng)根據(jù)藥物特點進(jìn)行試驗設(shè)計。

2.2.2 試驗制劑 參比制劑和受試制劑含量的差別不能超過5%。應(yīng)按產(chǎn)品標(biāo)示的而不是檢驗的濃度或含量給藥，給藥量不得按檢驗的結(jié)果做校正。生物等效性數(shù)據(jù)及其衍生參數(shù)也不應(yīng)按參比制劑和受試制劑含量的差別做校正。

2.2.3 動物 采用參比制劑標(biāo)簽規(guī)定的靶動物。每種靶動物均需單獨進(jìn)行生物等效性試驗。

2.2.4 給藥方案

2.2.4.1 單次/多次給藥 大多數(shù)情況，采用單次給藥。在下列情況下，可進(jìn)行多次給藥的生物等效性研究：藥物作用取決于血中被測物的穩(wěn)態(tài)濃度，活性成分是非線性和/或時間依賴性動力學(xué)，生物利用度個體差異大，吸收程度相差不大但吸收速度相差大，單次給藥后被測物濃度過低、分析方法不能準(zhǔn)確測得，治療指數(shù)小，吸收延長或推遲，吸收速度小于消除速度，控、緩釋制劑，分析方法的靈敏度不夠、不能定量測得峰濃度后3個消除半衰期以后的濃度等。

2.2.4.2 給藥劑量 一般，沒有證明線性動力學(xué)的受試制劑應(yīng)采用參比制劑批準(zhǔn)的劑量，劑量是標(biāo)簽的標(biāo)示量，而不是實測值，受試制劑和參比制劑的劑量應(yīng)相同。若參比制劑同一靶動物中批準(zhǔn)了多個給藥劑量，則應(yīng)選用批準(zhǔn)的最高劑量。如果能夠證明參比制劑在標(biāo)簽標(biāo)示范圍內(nèi)藥動學(xué)特征(PK)呈線性，也可采用標(biāo)簽低劑量。為達(dá)到有效的可測藥物濃度，安全指數(shù)大且PK呈線性的藥物，也可選用比批準(zhǔn)劑量高2～3倍的劑量，但需提供劑量選擇支持?jǐn)?shù)據(jù)和靶動物的耐受性數(shù)據(jù)。

2.2.4.3 給藥途徑 受試制劑和參比制劑應(yīng)采用相同的給藥途徑和給藥部位。

2.2.4.4 飼喂和禁食 所有種屬動物，飼喂應(yīng)符合動物福利。犬貓及非反芻動物用的內(nèi)服普通制劑，應(yīng)進(jìn)行禁食的生物等效性試驗，除非參比制劑標(biāo)簽中明確標(biāo)示僅用于飼喂后動物。對要求與飼料一起給藥的獸藥，動物應(yīng)先行飼喂。對飼喂可能影響吸收的獸藥，受試動物應(yīng)禁食。對于某些藥物如腸溶制劑或內(nèi)服緩釋制劑，由文獻(xiàn)或預(yù)試驗得知飼喂條件下藥物的生物利用度有較大變化時，必須同時在飼喂和禁食條件下證明生物等效性。

具有線性動力學(xué)產(chǎn)品，應(yīng)選擇合適的給藥方案(劑量、給藥間隔時間、給藥次數(shù))以獲得穩(wěn)態(tài)濃度。要測定連續(xù)的3個峰濃度(Cmax)或谷濃度(Ctrough)，或者通過在一個給藥間隔內(nèi)收集大約10份樣品(包括剛好在下次給藥之前采集的樣品)以證明達(dá)穩(wěn)態(tài)。達(dá)穩(wěn)態(tài)后，應(yīng)由末次給藥的藥-時曲線計算AUC和需關(guān)注的藥動學(xué)參數(shù)。對于受晝夜節(jié)律影響的藥物，應(yīng)連續(xù)24 h取樣。

對于內(nèi)源性物質(zhì)，采樣方案應(yīng)該能夠?qū)γ總€受試動物在每個周期表征內(nèi)源性基線。通常從2～3個給藥前樣品中測得基線。在其他情況下，可能需要給藥前1～2 d周期性采樣，以獲得時辰節(jié)律造成的內(nèi)源性基線波動。

2.2.6 檢測物質(zhì) 一般原則：母體化合物的Cmax通常對檢測產(chǎn)品間吸收速率的差異比代謝物的Cmax更敏感，因此，評價生物等效性應(yīng)該基于母體化合物的濃度。

非活性前藥：即使是非活性前藥，也推薦證明母體化合物的生物等效性，不必測量活性代謝物。但是某些前藥可能血漿濃度很低，并且快速清除，導(dǎo)致難于證明母體化合物的生物等效性。在此情形下，可以接受用主要活性代謝物來證明生物等效性。

使用代謝物替代活性母體化合物：只有在例外情況下，才會考慮以一個代謝物代替活性母體化合物。當(dāng)使用代謝物替代活性母體化合物時，申請人應(yīng)提交任何可得到的數(shù)據(jù)，以支持代謝物的暴露能反映母體化合物吸收，且證明該代謝物的生成在治療劑量下不飽和。

對映異構(gòu)體：一般可以接受使用非手性生物分析方法評價生物等效性。但是當(dāng)滿足以下全部條件或未知時，則應(yīng)該測定單一對映體：對映異構(gòu)體的藥動學(xué)有差異；對映異構(gòu)體的藥效學(xué)差異顯著；對映異構(gòu)體的暴露(AUC)比值在不同吸收速率下發(fā)生變化。

如果一個對映體是藥理活性的，另一個是非活性的，或?qū)钚缘呢暙I(xiàn)很小，則用活性對映體就足以證明生物等效性。

內(nèi)源性物質(zhì)：對于內(nèi)源性藥物的生物等效性試驗，可以考慮超治療劑量給藥。

2.2.7 藥動學(xué)參數(shù)計算 一般用非房室數(shù)學(xué)模型分析方法來估算藥代動力學(xué)參數(shù)。在生物等效性研究中，其主要測量參數(shù)Cmax和tmax均以實測值表示。AUC0→t以梯形法計算，故受數(shù)據(jù)處理程序影響不大。

在測定單劑量給藥后的生物等效性試驗中，應(yīng)當(dāng)測定受試制劑和參比制劑的AUC0→t、AUC0→∞、Cmax和tmax等參數(shù)。

在穩(wěn)態(tài)下測定普通制劑生物等效性的試驗中，提供受試制劑和參比制劑的3次谷濃度數(shù)據(jù)(Ctrough)，達(dá)穩(wěn)態(tài)后的AUCτ、Cmax.ss、Ctrough、tmax.ss、DF 等參數(shù)。

2.2.8 等效判斷標(biāo)準(zhǔn) 在單劑量給藥測定生物等效性的試驗中，參比制劑和受試制劑Cmax和AUC幾何均值比的90%置信區(qū)間應(yīng)該落在可接受范圍80.00%～120.00%(AUC未做對數(shù)轉(zhuǎn)換)或80.00%～125.00%(AUC做過對數(shù)轉(zhuǎn)換)范圍內(nèi)。為了落在接受范圍內(nèi)，下限舍入后保留兩位小數(shù)應(yīng)≥80.00%，上限舍入后保留兩位小數(shù)應(yīng)≤125.00%。

AUC0→t至少應(yīng)覆蓋AUC0→∞的80%，如果覆蓋小于80%的受試動物超過總數(shù)的20%，則需要討論該試驗的有效性。

2.2.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2.2.9.1 數(shù)據(jù)表達(dá) BE研究必須提供所有個體濃度測定數(shù)據(jù)和藥代動力學(xué)參數(shù)，并提供匯總數(shù)據(jù)。如所有受試動物各個時間點受試制劑和參比制劑的藥物濃度測定數(shù)據(jù)、每一時間點的平均濃度(Mean)及其標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，提供每個受試動物的濃度-時間曲線(C-T 曲線)、平均C-T 曲線以及C-T 曲線各個時間點的標(biāo)準(zhǔn)差。對于需進(jìn)行統(tǒng)計分析的藥代動力學(xué)參數(shù)，應(yīng)提交對受試制劑和參比制劑比值的點估計及90%置信區(qū)間。對于單次給藥研究，應(yīng)報告每周期每只動物的AUC0→t占AUC0→∞的百分比。不能隨意剔除任何數(shù)據(jù)。脫落動物的數(shù)據(jù)一般不可用其他數(shù)據(jù)替代。

2.2.9.2 分析中數(shù)據(jù)剔除 應(yīng)該盡量避免剔除數(shù)據(jù)，否則，可評價的受試動物數(shù)量會減少，剔除數(shù)據(jù)后試驗效力會下降。試驗方案中應(yīng)有剔除標(biāo)準(zhǔn)，如內(nèi)服制劑存在嘔吐風(fēng)險，因嘔吐導(dǎo)致丟失的部分或全部給藥劑量，因此，試驗方案中預(yù)先設(shè)定與嘔吐有關(guān)的數(shù)據(jù)剔除標(biāo)準(zhǔn)。此外，試驗中可選擇在動物嘔吐后重復(fù)給藥，其標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)在試驗方案中預(yù)先說明。對此的例外是，由于受試動物未按規(guī)定給藥，或者清洗期不夠，此時可以質(zhì)疑該試驗的有效性。從統(tǒng)計分析中剔除的受試動物樣本仍然需要測定，并列出結(jié)果。

2.2.9.3 統(tǒng)計分析 評價生物等效性的最合適方法是雙單側(cè)t檢驗法和(1-2a)%置信區(qū)間法。該法可用于各參數(shù)如AUC、Cmax，包括做自然對數(shù)轉(zhuǎn)換或未做自然對數(shù)轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)。

AUC是AUC0→t與AUCt→∞之和。AUCt→∞是最后一次采樣到無窮時間藥-時曲線下面積，按AUCt→∞=Ct/λz計算。

AUC0→t采用線性曲邊梯形法計算。如果采樣時間落在消除相，則需考慮用對數(shù)曲邊梯形法或其他方法。

AUC、Cmax和tmax一般用實測值而不用理論值。AUC和Cmax應(yīng)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后用多因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗，然后再用雙單側(cè)t檢驗法和90%可信區(qū)間法判斷獸藥的生物等效性。

AUC0→τ是評價多次給藥生物等效性的主要參數(shù)，平均穩(wěn)態(tài)濃度(Css)是另一評價吸收程度的重要指標(biāo)。

測定Cmax.ss和tmax.ss，還要測定藥物濃度在Cmax.ss和Cmin.ss之間的波動范圍(DF)，也可用于評價多次給藥的生物等效性，但要結(jié)合臨床做具體分析。

3 內(nèi)服緩、控釋制劑

緩、控釋制劑改變了藥物釋放和吸收的過程，這些制劑的生物等效性試驗與普通制劑有所不同。一般要求同時進(jìn)行單次給藥和多次給藥研究，必要時還應(yīng)考慮飼喂的影響。

3.1 單次給藥 試驗設(shè)計基本同普通制劑。生物等效性評價標(biāo)準(zhǔn)同普通制劑。若以緩、控釋制劑為參比制劑，AUC、Cmax、tmax均符合生物等效性統(tǒng)計學(xué)要求的，可認(rèn)定兩制劑于單次給藥條件下是生物等效的。若以普通制劑為參比制劑，AUC符合生物等效性的一般要求但Cmax明顯降低、tmax明顯延遲，則說明該制劑具有緩釋或控釋動力學(xué)特征。

3.2 多次給藥 等效性評價一般同緩、控釋制劑的單次給藥，但Ctrough是需要考慮的重要參數(shù)。當(dāng)以普通制劑為參比制劑時，對于波動系數(shù)的評價，應(yīng)結(jié)合緩、控釋制劑本身的特點做具體分析。

另外，對于不同的緩、控釋劑型，還應(yīng)根據(jù)劑型的特殊性進(jìn)行試驗設(shè)計，增加相應(yīng)考察指標(biāo)，以體現(xiàn)劑型的特點。

4 復(fù)方制劑

一個組分的體內(nèi)行為不可能完全代表其它組分的體內(nèi)行為，故原則上應(yīng)證實每一個主要有效成分的生物等效性。試驗設(shè)計時應(yīng)盡量兼顧各個成分的特點。

5 結(jié) 語

綜上所述，新修訂的《獸用化學(xué)藥品血藥濃度法生物等效性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》是在農(nóng)業(yè)部公告第1247號發(fā)布的《獸用化學(xué)藥品生物等效性試驗指導(dǎo)原則》基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)外獸藥研究現(xiàn)狀修訂的，其基本原則與WHO[2-3]、VICH GL52[4]、FDA[5]、EMA[6]、CFDA[7]的相同，該指導(dǎo)原則的發(fā)布實施將為進(jìn)一步規(guī)范我國獸藥生物等效性研究試驗提供技術(shù)指導(dǎo)，對獸藥行業(yè)水平的整體提升也將起到積極地促進(jìn)作用。