趙富華，陸連壽，劉自揚(yáng)，李 萌，李思奇，郭桂芳，吳琴堯 ，曹玉穎， 邱基程，李淑媛，張 璐，龔曉會(huì)， 郭燕熒，張希墨*，曹興元*

(1 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；3 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

多西環(huán)素為第二代半合成的四環(huán)素衍生物，為廣譜、高效抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、螺旋體、立克次體、支原體、衣原體等均有抑制作用[1]。鹽酸多西環(huán)素的組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)分布廣和生物利用度高[2]，與同類產(chǎn)品比較，它有價(jià)格便宜，胃腸道副作用小，靜脈給藥不會(huì)造成靜脈炎等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于獸醫(yī)臨床。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會(huì)和國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)，多西環(huán)素在豬組織中的最高殘留限量(MRL)：肌肉100 μg/kg、肝300 μg/kg、腎600 μg/kg、皮+脂肪300 μg/kg[3]。同時(shí)，農(nóng)業(yè)部《獸藥停藥期規(guī)定》規(guī)定了鹽酸多西環(huán)素片的休藥期為28日，但未明確動(dòng)物的類型[4]。本試驗(yàn)的主要目的在于研究口服給予鹽酸多西環(huán)素片后，多西環(huán)素在豬組織中的殘留消除規(guī)律，并計(jì)算出休藥期，為鹽酸多西環(huán)素片在臨床應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)，保障動(dòng)物性食品安全和人民健康。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 鹽酸多西環(huán)素片：10 mg/片，批準(zhǔn)文號(hào)為獸藥字030462604，河北遠(yuǎn)征禾木藥業(yè)有限公司提供。多西環(huán)素對(duì)照品：含量≥98.7%，批號(hào)為20104，購自德國Dr. Ehrensorfer公司；Oasis HLB固相萃取柱(HLB柱)：500 mg/6 mL，Waters公司；超純水：由Milli-Q超純水儀制??；乙腈、甲醇色譜純；三氟乙酸、二氯甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、枸櫞酸、磷酸氫二鈉、草酸、硫酸、鎢酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀：Agilent 1260 高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測器；分析天平，R200D，德國Sartofius公司；天平，MP2002，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；研磨杯，SQ2119 N，上海帥佳電子科技公司；高速冷凍離心機(jī)，Centrifuge 5804R，德國Eppendorf公司；多管渦旋混合器，VX-III，北京踏錦科技有限公司；固相萃取裝置：Waters 200606，美國Waters公司；氮吹儀，N-EVAP-112，美國Organomation Associate公司；無油真空泵，F(xiàn)-50，天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 三元雜交健康豬30頭，去勢雄性豬，3-4月齡，體重約50 kg，由萊西市某豬養(yǎng)殖廠提供。其中對(duì)照組5頭，給藥組25頭。

1.4 給藥方案 用EXCEL隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)30頭豬進(jìn)行隨機(jī)分組，分為6組，每組5頭，其中1組為不用藥的空白對(duì)照組，另外5組豬以口服方式給藥，每頭豬給藥劑量為0.5片/kg。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取適量的多西環(huán)素，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，再用甲醇定容。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要用流動(dòng)相將多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.6 組織采集 最后一次給藥后分別在12 h、1 d、3 d、6 d和8 d，隨機(jī)抽取5頭豬進(jìn)行屠宰，快速取其肌肉、脂肪、肝臟和腎臟等組織(每種組織樣品均250 g)，用濾紙吸取臟器表面血液。所取樣本做好標(biāo)記、包裝，于-20 ℃保存。未用藥豬在12 h后屠宰，采用上述方法采集相同組織作為空白對(duì)照。

1.7 樣品前處理

1.7.1 提取 脂肪：稱取均質(zhì)試料1±0.01 g于10 mL離心管中，加ACN： H2O=1:9的溶液2 mL，渦旋混勻1 min，40 ℃超聲5 min，4 ℃下12000 rpm高速離心10 min，取上清液于另一離心管。將殘?jiān)貜?fù)上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，-80 ℃冷凍除脂5 min，4 ℃下12000 rpm離心5 min，取上清液，直接過濾膜，上機(jī)檢測。

肌肉、肝臟：稱取均質(zhì)試料5±0.05 g于50 mL離心管中，加 EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液5 mL、7%鎢酸鈉溶液5 mL，渦旋1 min，4 ℃下8500 rpm離心5 min，取上清液。殘?jiān)肊DTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液20 mL、10 mL重復(fù)提取，合并三次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

腎臟：稱取均質(zhì)試料2±0.02 g，于50 mL離心管中，加 EDTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液2 mL、7%鎢酸鈉溶液2 mL，渦旋1 min，4 ℃下8500 rpm離心5 min，取上清液。殘?jiān)肊DTA·2 Na-Mcllvaine緩沖溶液10 mL、10 mL重復(fù)提取，合并三次上清液，中性濾紙過濾后，備用。

1.7.2 凈化 HLB柱依次用甲醇5 mL、水5 mL和EDTA· 2 Na-Mcllvaine緩沖溶液5 mL活化，取備用液過柱，待備用液全部流出后，依次用水、5%甲醇溶液各10 mL淋洗，抽干30 s，用甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液于刻度試管中，于40 ℃水浴氮?dú)獯抵?.5～1.0 mL，用0.01 mol/L草酸溶液定容至2.0 mL，過濾，供高效液相色譜測定。

1.8 色譜條件 色譜柱：C18(150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)；流動(dòng)相：A：0.01 mol/L三氟乙酸溶液，B：乙腈；梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm；進(jìn)樣量：50 μL。見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 線性與范圍 精密量取濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液各50 μL，供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為Y=0.044x-0.414，R2=0.999，多西環(huán)素在50 μg/mL～5000 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 檢測線與定量限 取6個(gè)空白組織樣品，按照上述樣品前處理的方法處理，測得基線噪音值，按照信噪比(S/N) = 3 為檢測限(LOD)，S/N=10 為定量限(LOQ)。本方法在豬的肌肉組織中檢測限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg；在豬的肝臟組織、腎臟組織、皮+脂肪的檢測限為50 μg/kg，定量限為100 μg/kg。

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度 在空白組織中添加多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使肌肉組織中的濃度為50 μg/kg，100 μg/kg，200 μg/kg時(shí)，腎臟組織中的多西環(huán)素濃度為100 μg/kg，600 μg/kg，1200 μg/kg時(shí)，肝臟組織和脂肪組織中濃度為100 μg/kg，300 μg/kg，600 μg/kg時(shí)，平均回收率在60.32%～116.80%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%，表明該方法符合組織中藥物分析的準(zhǔn)確度和精密度要求，見表2。鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.8色譜條件下，待測藥物鹽酸多西環(huán)素在圖譜中能夠呈現(xiàn)較好的峰形，并與其他雜質(zhì)峰達(dá)到良好的分離效果，詳見圖1。

表2 多西環(huán)素在豬肌肉和腎臟中的回收率及變異系數(shù)Tab 2 Recovery and coefficient of variation of doxycycline in pig muscle and kidney

圖1 鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 ng/mL)(a)、空白肌肉組織色譜圖(b)、空白肌肉組織添加100 ng/mL色譜圖(c)Fig 1 Chromatography of doxycycline hydrochloride standard solution (100 ng/mL)(a)、Chromatography of blank muscle tissue (b)、Chromatography of blank muscle with 100 ng/mL(c)

2.2 藥物殘留的測定 每個(gè)采樣時(shí)間的每個(gè)組織的多西環(huán)素殘留量如表3所示。

表3 豬組織樣品中多西環(huán)素在各組織中的殘留量Tab 3 Residues of doxycycline in tissues after administration

續(xù)表

2.3 休藥期計(jì)算 使用WT 1.4軟件按95%置信區(qū)間計(jì)算鹽酸多西環(huán)素在豬肌肉、肝臟和腎臟組織中的休藥期分別為2.4日、6.5日、3.5日，見圖2-圖4。

圖2 鹽酸多西環(huán)素片在豬肌肉中休藥期計(jì)算圖Fig 2 Calculation chart of drug withdrawal period of doxycycline hydrochloride tablets in pig muscle

圖3 鹽酸多西環(huán)素片在豬肝臟中休藥期計(jì)算圖Fig 3 Calculation chart of drug withdrawal period ofdoxycycline hydrochloride tablets in pig liver

圖4 鹽酸多西環(huán)素片在豬腎臟中休藥期計(jì)算圖Fig 4 Calculation chart of drug withdrawal period of doxycycline hydrochloride tablets in pig kidney

3 討論與結(jié)論

我國動(dòng)物性食品生產(chǎn)量居世界前列，但質(zhì)量與世界先進(jìn)水平相比還存在差距，獸藥殘留超標(biāo)是其中之一。因此在嚴(yán)格規(guī)范獸藥使用原則的前提下，還要加強(qiáng)動(dòng)物性食品中獸藥殘留檢測技術(shù)及方法的研究。目前，抗生素已被廣泛用于預(yù)防或治療牲畜傳染病[5]，加大對(duì)抗生素及其代謝物檢測研究力度，有助于積累其對(duì)環(huán)境持久性和生態(tài)毒性的科學(xué)證據(jù)[6-7]，為獸藥使用安全、食品安全與人民健康提供保障。

目前，已有研究報(bào)道了鹽酸多西環(huán)素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留消除規(guī)律，楊秋實(shí)[8]以10 mg/kg體重劑量給豬頸部肌肉注射鹽酸多西環(huán)素，隔天再次注射，發(fā)現(xiàn)組織中多西環(huán)素殘留由高到低順序?yàn)椋耗I臟>肝臟>肌肉>皮+脂肪；黃聚杰[9]以20 mg/kg的劑量給花鱸口服鹽酸多西環(huán)素，發(fā)現(xiàn)組織中多西環(huán)素殘留由高到低順序?yàn)椋貉獫{>腎臟>肝臟>肌肉；翟克影[10]等人給豬單次灌服5 mg/kg體重劑量連續(xù)給藥4日，發(fā)現(xiàn)組織中多西環(huán)素殘留由高到低順序?yàn)椋耗I臟>肝臟>肌肉>皮+脂肪；王金花[11]等人以2.5 mg/kg單劑量肌肉注射豬，發(fā)現(xiàn)組織中多西環(huán)素殘留由高到低的順序?yàn)椋耗I臟>皮+脂肪>肌肉>肝臟；本次試驗(yàn)結(jié)果與上述試驗(yàn)結(jié)果基本一致，給藥后殘留濃度順序依次為：腎臟>肝臟>肌肉>脂肪。

此外，有研究報(bào)道了不同劑型的鹽酸多西環(huán)素在豬體內(nèi)的休藥期，黃耀凌[12]等人的試驗(yàn)中，自制鹽酸多西環(huán)素注射液以10 mg/kg體重劑量對(duì)豬肌內(nèi)注射給藥，連續(xù)給藥3日，建議休藥期為42日，休藥期較長；李媚[13]等人以10 mg/kg體重劑量于試驗(yàn)豬頸部肌內(nèi)注射長效鹽酸多西環(huán)素注射液，給藥2次，給藥間隔時(shí)間為48 h，建議休藥期為28日；劉欣[1]等人以10 mg/kg體重劑量服用鹽酸多西環(huán)素顆粒后，連續(xù)給藥5日，建議休藥期為12日。本文采用HPLC-VWD方法檢測了豬按照5 mg/kg體重劑量口服鹽酸多西環(huán)素片后在不同時(shí)間點(diǎn)各組織中多西環(huán)素的殘留量，使用WT 1.4軟件按95%置信區(qū)間計(jì)算出鹽酸多西環(huán)素片的休藥期為7日。上述試驗(yàn)中的休藥期均比本試驗(yàn)的休藥期長，但是殘留結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本相似，其原因可能與劑型和給藥方式不同有關(guān)，鹽酸多西環(huán)素在豬體內(nèi)主要通過肝臟和腎臟進(jìn)行代謝，且消除速度較慢，不同劑型和給藥方式對(duì)其影響明顯。

綜上所述，建議鹽酸多西環(huán)素片在豬體內(nèi)的休藥期為7日。