師建茹，高耀，趙慧亮，田俊生*，武嫣斐*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院, 山西 太原 030001；2. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006)

抑郁癥是以情緒異常低落為主要臨床表現(xiàn)的精神疾病，嚴(yán)重者可能導(dǎo)致自殺，具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致殘率高等特點(diǎn)，到2030年將成為全球僅次于缺血性心臟病的第二位疾病負(fù)擔(dān)源，其危害已引起全世界醫(yī)藥衛(wèi)生界的重視[1-2]。對(duì)個(gè)人而言，其年患病率為6.6%，而終身患病率高達(dá) 16.2%[3]。目前臨床多用西藥治療，但有一定的毒副作用。因此，尋找有效、安全、依從性好的治療方法受到人們的普遍關(guān)注。

抑郁癥多歸屬于中醫(yī)“郁證”范疇，《醫(yī)碥》言“郁而不舒，則皆肝木之病。”由此可見(jiàn)肝與郁證密不可分。陳士鐸《石室秘錄》言 “夫郁者，未有不傷肝者?！睘楹笫泪t(yī)家從肝論治郁證奠定了理論基礎(chǔ)。葉天士《臨證指南醫(yī)案·郁》所載的醫(yī)案均屬情志之郁，治則多以舒肝理氣為主。同時(shí)有部分學(xué)者提出肝主疏泄，對(duì)于應(yīng)激事件所產(chǎn)生的反應(yīng)起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，這與中醫(yī)認(rèn)為肝失疏泄致抑郁癥發(fā)病的觀點(diǎn)不謀而合[4]。

逍遙散源于宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、生姜、白芍、薄荷 8 味藥組成，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，是疏肝解郁的經(jīng)典方之一。實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用均表明[5-8]，逍遙散具有確切的治療抑郁癥的作用。柴胡[9]、白芍[10]、當(dāng)歸[11]、薄荷[12]單味藥也具有抗抑郁的功效。施學(xué)麗等[13]采用應(yīng)用關(guān)聯(lián)規(guī)則、聚類方法等數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析治療抑郁癥的中藥專利復(fù)方組方配伍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)逍遙散為治療抑郁癥的基本方。因此，圍繞逍遙散的藥性與功效的內(nèi)在聯(lián)系研究逍遙散抗抑郁的作用機(jī)制具有重要意義。

《神農(nóng)本草經(jīng)》序錄云“藥有酸咸甘苦辛五味，又有寒熱溫涼四氣?！彼臍?，就是寒熱溫涼四種不同的藥性，又稱四性，反映了藥物對(duì)人體陰陽(yáng)盛衰、寒熱變化的作用傾向，為藥性理論重要組成部分。藥性的寒熱溫涼是根據(jù)藥物作用于人體產(chǎn)生的不同反應(yīng)和療效總結(jié)出來(lái)的，其與所治疾病的性質(zhì)是相對(duì)而言的[14]。王耘等[15]提出藥性組合與功效相結(jié)合的研究思路，從藥性角度分析抗衰老中藥并闡釋不同類別的藥性特征。吳東雪等[16]以代表性中藥的活性成分作用靶標(biāo)及其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用( protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模塊的功能識(shí)別為橋梁，銜接藥性和功效，探討活血化瘀藥性效關(guān)系。侯寧等[17]進(jìn)行了基于藥性組合的丹參和紅花的性效關(guān)系研究。朱艷玲[18]總結(jié)了歸肝經(jīng)藥物四性規(guī)律，歸肝經(jīng)性寒涼藥物居多，從五味分析，辛味或苦味居多；歸肝經(jīng)性溫?zé)崴幬铮瑥奈逦斗治?，味辛者居多?/p>

因此，本實(shí)驗(yàn)圍繞逍遙散中溫辛肝藥性、寒苦肝藥性進(jìn)行分析，以逍遙散中柴胡、白芍(寒苦肝藥性、寒苦心藥性)、當(dāng)歸、薄荷(溫辛肝藥性、溫辛心藥性)為研究載體，通過(guò)成分-靶點(diǎn)-蛋白分析，構(gòu)建藥性組合PPI網(wǎng)絡(luò)，說(shuō)明柴胡、白芍、當(dāng)歸和薄荷同歸肝經(jīng)藥性的共性特征和寒苦藥性、溫辛藥性在發(fā)揮疏肝解郁功效上的差異，從而闡釋疏肝解郁中藥氣味組合與功效的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究載體的選取

中藥的性能，是指藥物與療效有關(guān)的性質(zhì)與功能，四氣、五味為中藥的基本藥性。2020年版《中國(guó)藥典》[19]中記載柴胡味苦、辛，性微寒，歸肝、膽經(jīng)，功能疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽(yáng)氣；白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，功能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)；當(dāng)歸味甘、辛、苦，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，功能補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便，潤(rùn)燥滑腸；薄荷味辛，性溫，歸肺、肝經(jīng)，功能疏散風(fēng)熱，清利頭目，利咽，透疹，疏肝行氣。肝與郁證密不可分，因此本文對(duì)肝經(jīng)進(jìn)行深入的研究。本文選擇具有疏肝解郁功效的寒苦肝藥性和溫辛肝藥性作為研究載體，其中寒苦肝藥性選取了柴胡和白芍，溫辛肝藥性選取了當(dāng)歸和薄荷。

1.2 中藥成分的篩選

以逍遙散中寒苦肝藥性為例，利用TCM database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[20]、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)[21]、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[22]數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合文獻(xiàn)挖掘的方法收集柴胡、白芍的主要化學(xué)成分，匯總得到寒苦肝藥性中柴胡和白芍的主要有效成分。同理可獲取溫辛肝組合中藥當(dāng)歸和薄荷的主要有效成分。

1.3 藥性組合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)

應(yīng)用BATMAN-TCM 分析平臺(tái)，在線獲取逍遙散中寒苦肝藥性中柴胡和白芍主要有效成分的靶點(diǎn)信息，并選擇其中高可信度的蛋白作為候選靶點(diǎn)(prediction score cutoff >20)。由于檢索到的藥物靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范等問(wèn)題，因此，本實(shí)驗(yàn)使用 UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中 UniProtKB 搜索功能(http://www.uniprot.org/，Update in 2014-04-10)，通過(guò)輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱(official symbol)，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)信息。同理可獲取逍遙散中溫辛肝藥性中中藥當(dāng)歸和薄荷的主要有效成分靶點(diǎn)。

1.4 藥性組合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將靶點(diǎn)信息整合后導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1 平臺(tái)，應(yīng)用Advanced Network Merge 插件[23]中的Union計(jì)算得到全集網(wǎng)絡(luò)，即逍遙散中寒苦肝藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；同理構(gòu)建逍遙散中溫辛肝藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Advanced Network Merge插件中的Intersection和Difference計(jì)算對(duì)上述2個(gè)藥性組合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)取交、補(bǔ)集，分別得到交集靶點(diǎn)群為2個(gè)藥性組合共有靶點(diǎn)集，即逍遙散中歸肝經(jīng)藥性的作用靶點(diǎn)群，補(bǔ)集部分分別為逍遙散中寒苦藥性的獨(dú)特靶點(diǎn)群和溫辛藥性的獨(dú)特靶點(diǎn)集。通過(guò)對(duì)2個(gè)藥性組合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的交補(bǔ)集進(jìn)行分析，可以對(duì)比解析逍遙散中歸肝經(jīng)藥性的共性特征和寒苦藥性疏肝解郁藥的特異性特征及溫辛藥性疏肝解郁的特異性特征。

1.5 藥性組合靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[24]對(duì)藥性組合蛋白進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG )通路分析，設(shè)置閾值P< 0.01，篩選出排名靠前的 KEGG 通路。Metascape 采用一種啟發(fā)式算法從得到的簇中選擇信息量最大的術(shù)語(yǔ)。KEGG通路P值越小，標(biāo)記的顏色越深。節(jié)點(diǎn)可以通過(guò)其群集ID或其P值進(jìn)行著色。邊緣連接相似的術(shù)語(yǔ)越多，相似性越高。分別構(gòu)建逍遙散中歸肝經(jīng)藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、寒苦藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和溫辛藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行功能分析。對(duì)上述功能注釋進(jìn)行分類和對(duì)比，結(jié)合文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)，研究逍遙散中歸肝經(jīng)藥性的共性特征及寒苦藥性、溫辛藥性的特異性特征。同時(shí)，基于中藥藥性理論，結(jié)合文獻(xiàn)中對(duì)靶點(diǎn)和模塊的現(xiàn)代藥理學(xué)研究，分析逍遙散中疏肝解郁中藥的化學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)，闡釋藥性與功效的內(nèi)在聯(lián)系。本文具體技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

圖1 逍遙散中寒苦肝和溫辛肝性效關(guān)系研究技術(shù)路線圖Fig.1 Technical roadmap for the nature-effect relationship research of cold bitter and warm pungent medicinal properties of Xiaoyaosan

2 結(jié)果

2.1 藥性組合成分和靶點(diǎn)信息

通過(guò) TCM database@Taiwan、TCMID 和BATMAN-TCM 等數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)挖掘，篩選高可信度的蛋白作為候選靶點(diǎn)，去除沒(méi)有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分。篩選結(jié)果：柴胡共 67 個(gè)成分，白芍共 18 個(gè)成分，當(dāng)歸共 97 個(gè)成分，薄荷共 23 個(gè)成分，共獲得 85 個(gè)逍遙散中寒苦肝藥性有效成分和 116 個(gè)溫辛肝藥性有效成分。作用靶點(diǎn)來(lái)源于BATMAN-TCM 分析平臺(tái)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲取逍遙散中寒苦肝藥性作用靶點(diǎn) 1127 個(gè)，溫辛肝藥性作用靶點(diǎn) 1389 個(gè)，部分靶點(diǎn)信息見(jiàn)表 1。經(jīng)篩選后 2 個(gè)藥性的有效成分個(gè)數(shù)存在差異，但以相同方法獲取靶點(diǎn)后，2 個(gè)藥性組合的靶點(diǎn)數(shù)相當(dāng)，對(duì)后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊識(shí)別影響較小，故有效成分?jǐn)?shù)量的差異，對(duì)最終的分析結(jié)果無(wú)較大影響。

表1 逍遙散中藥性組合的部分靶點(diǎn)信息Table 1 Partial target information of drug combinations in Xiaoyaosan

2.2 藥性組合PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

搜索 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取各靶點(diǎn)相關(guān)的PPI信息。以交集逍遙散中苦肝藥性靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)為例，將靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的PPI信息導(dǎo)入 Cytoscape 3.5.1，取最大連通子圖為歸肝經(jīng)藥性的PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含 946 個(gè)節(jié)點(diǎn)、6748 條邊。同理，構(gòu)建逍遙散中寒苦藥性靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)和溫辛藥性靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中逍遙散中寒苦藥性靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包括28個(gè)節(jié)點(diǎn)、24條邊；溫辛藥性靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)包含 274 個(gè)節(jié)點(diǎn)、899 條邊。

2.3 不同組合藥性PPI網(wǎng)絡(luò)的功能分析

通過(guò) Metascape 對(duì)不同組合藥性PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行KEGG功能分析，其中，逍遙散中歸肝經(jīng)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、多巴胺能突觸、血清素能突觸、膽堿能突觸、酪氨酸代謝、味覺(jué)傳導(dǎo)、嘌呤代謝、TRP通道的炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)、MAPK 信號(hào)通路、色氨酸代謝、肌萎縮側(cè)索硬化、Rap1 信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝、甾體激素生物合成等發(fā)揮疏肝解郁的功效。如圖 2 所示。

圖2 逍遙散中歸肝經(jīng)藥性KEGG通路圖Fig.2 KEGG pathway of the liver meridian medicinal property of Xiaoyaosan

逍遙散中寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁分泌、MAPK 信號(hào)通路、IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、催產(chǎn)素信號(hào)通路、Hipp 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、胰島素抵抗、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)通路等發(fā)揮疏肝解郁的功效，如圖3所示。

圖3 逍遙散中寒苦藥性KEGG 通路圖Fig.3 KEGG pathway of the cold bitter medicinal property of Xiaoyaosan

逍遙散中溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)活性配體-受體相互作用，半胱氨酸和蛋氨酸代謝，嘧啶代謝，cAMP信號(hào)通路，氨基酸生物合成，維生素消化和吸收，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路，腎素-血管緊張素系統(tǒng)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，膽堿能突觸，甘油磷脂代謝等發(fā)揮疏肝解郁的功效，如圖 4 所示。

圖4 逍遙散中溫辛藥性KEGG 通路圖Fig.4 KEGG pathway of the warm symplectic medicinal property of Xiaoyaosan

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可以看出(表2)，逍遙散中寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)和溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)均與維生素轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素抵抗有關(guān)。溫辛藥性、歸肝經(jīng)藥性和溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)均與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、cAMP 信號(hào)通路、膽堿能突觸有關(guān)。逍遙散中寒苦藥性、歸肝經(jīng)藥性和溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)均與 MAPK 信號(hào)通路、腎上腺素能信號(hào)通路的反應(yīng)有關(guān)。逍遙散中寒苦藥性、溫辛藥性和歸肝經(jīng)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)均與行為學(xué)有關(guān)。逍遙散中疏肝解郁中藥可以通過(guò)影響上述信號(hào)通路等發(fā)揮抗抑郁的作用。因此推測(cè)這3個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)中的中藥可能具有預(yù)防和治療抑郁癥的作用。

表2 逍遙散中不同藥性的功能列表Table 2 A list of functions of different medicinal properties of Xiaoyaosan

進(jìn)一步對(duì)逍遙散中寒苦肝藥性和溫辛肝藥性性效關(guān)系進(jìn)行梳理，如圖5所示。逍遙散中寒苦藥性蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的通路富集發(fā)現(xiàn)，逍遙散中寒苦藥性對(duì)應(yīng)的功能包括能量代謝和炎癥反應(yīng)；逍遙散中溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)的通路富集發(fā)現(xiàn)，逍遙散中溫辛藥性對(duì)應(yīng)的功能包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和氨基酸代謝。逍遙散中歸肝經(jīng)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)的通路富集發(fā)現(xiàn)，逍遙散中歸肝經(jīng)藥性蛋白對(duì)應(yīng)的功能包括神經(jīng)遞質(zhì)、信號(hào)通路和內(nèi)分泌。由此發(fā)現(xiàn)，不同藥性網(wǎng)絡(luò)對(duì)應(yīng)不同的功能，這些功能可能在逍遙散抗抑郁中發(fā)揮重要的作用。

圖5 逍遙散中寒苦肝藥味和溫辛肝藥味性效關(guān)系Fig.5 The relationship between the taste of cold and bitter liver medicine and the taste of warm pungent liver medicine of Xiaoyaosan

3 討論

PPI網(wǎng)絡(luò)是由各個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用組成的，這些蛋白參與生命過(guò)程的許多方面，例如生物信號(hào)傳遞、基因表達(dá)的調(diào)控、能量代謝等。對(duì)生物系統(tǒng)中大量PPI的分析有助于理解疾病發(fā)病的復(fù)雜機(jī)理以及藥物治療疾病的復(fù)雜機(jī)制。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取逍遙散中溫辛肝藥性、寒苦肝藥性的主要有效成分及作用靶點(diǎn)，對(duì)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能注釋和統(tǒng)計(jì)分析。該研究從分子網(wǎng)絡(luò)水平闡釋了逍遙散中歸肝經(jīng)藥性的共性特征和寒苦藥性、溫辛藥性的特異性特征。

歸肝經(jīng)藥物的性效規(guī)律與肝臟生理功能、病理特點(diǎn)關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙散歸肝經(jīng)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)主要通過(guò) HTR2B 等靶點(diǎn)參與神經(jīng)遞質(zhì)、信號(hào)通路、內(nèi)分泌發(fā)揮疏肝解郁的功效[25]。因此推測(cè)出逍遙散歸肝經(jīng)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)具有疏肝解郁的功效。

歸肝經(jīng)藥性寒涼的藥物味苦者最多，性寒味苦者清熱解毒的作用更大，治療熱性和熱毒病證，同時(shí)還具有清熱利濕、利水、止痛等的功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙散寒苦藥性網(wǎng)絡(luò)通過(guò) CREBRF 等靶點(diǎn)參與能量代謝、炎癥反應(yīng)發(fā)揮疏肝解郁的功效[26-27]，所以可以推測(cè)出逍遙散寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)具有疏肝解郁的功效。

歸肝經(jīng)藥性溫?zé)岬乃幬镂缎琳咦疃?，最明顯的功效是祛風(fēng)、除濕、強(qiáng)筋骨、止痛，反映出辛能行能散，還具有活血化瘀、行氣的功效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙散中溫辛藥性主要通過(guò) ADCY5等靶點(diǎn)參與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、氨基酸代謝發(fā)揮疏肝解郁的功效[28]。所以可以推測(cè)出逍遙散中溫性藥性PPI網(wǎng)絡(luò)具有疏肝解郁的功效。

雖然，逍遙散中寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)和溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)通過(guò)不同的靶點(diǎn)共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)胰島素抵抗等生命過(guò)程而發(fā)揮作用，但從功能分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)兩者是通過(guò)不同的靶點(diǎn)發(fā)揮作用的。本文通過(guò)構(gòu)建逍遙散中溫苦肝藥性、寒苦肝藥性兩個(gè)藥性組合中藥成分的PPI網(wǎng)絡(luò)，并基于模塊聚類分析方法對(duì)這兩個(gè)藥性PPI網(wǎng)絡(luò)的交補(bǔ)集進(jìn)行綜合分析，從分子網(wǎng)絡(luò)水平說(shuō)明了逍遙散中歸肝經(jīng)藥性的中藥可能具有神經(jīng)遞質(zhì)、信號(hào)通路、內(nèi)分泌等疏肝解郁功效。

逍遙散中寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝、炎癥反應(yīng)發(fā)揮功效。逍遙散中溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、氨基酸代謝等功效，其中寒苦藥性PPI網(wǎng)絡(luò)和溫辛藥性PPI網(wǎng)絡(luò)通過(guò)不同的靶點(diǎn)共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)胰島素抵抗等生命過(guò)程而發(fā)揮作用?！案斡簟笔清羞b散應(yīng)用的基礎(chǔ)，這些重要的生物學(xué)功能與藥性的關(guān)系用現(xiàn)代科學(xué)術(shù)語(yǔ)闡明了逍遙散疏肝解郁功效的科學(xué)內(nèi)涵，為逍遙散中的藥性與功效的內(nèi)在聯(lián)系研究提供了新思路和方法。