顧一丹，任允琰，章朱峰，高平

(無錫市第二中醫(yī)醫(yī)院 呼吸科，江蘇 無錫 214121)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中最常見的類型，是呼吸系統(tǒng)危重癥之一。患者起初僅表現(xiàn)為干咳，隨著肺纖維化加重，出現(xiàn)胸悶、呼吸困難、發(fā)紺等臨床表現(xiàn)[1]。肺纖維化不可逆，終末期患者多因心肺功能衰竭失救，目前中位生存期約為3～5年，低于多種癌癥[2]。IPF發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要認(rèn)為與免疫功能紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[3]。目前臨床暫無可以治愈IPF的藥物，指南推薦使用尼達(dá)尼布或吡非尼酮抗肺纖維化，但該類藥物僅推薦用于輕中度IPF患者，且只能達(dá)到延緩肺纖維化的效果，而不能有效改善患者臨床癥狀，療效未能令患者滿意[4- 5]。

中醫(yī)藥治療IPF具有一定優(yōu)勢，相關(guān)臨床研究證實(shí)中醫(yī)藥能改善IPF患者癥狀，提高生存質(zhì)量[6]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論無IPF病名，根據(jù)臨床癥狀多將IPF歸于“肺萎”范疇，其病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，重在虛和瘀。目前其辨證分型尚不統(tǒng)一，相關(guān)的證型分析研究指出，氣陰兩虛證在患者中占比最大，各醫(yī)家臨床治療亦以益氣養(yǎng)陰法施治最為常見，收效令人滿意。人參-五味子配伍出自孫思邈《千金要方》生脈散，有益氣養(yǎng)陰之功效，是臨床常用藥對?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參-五味子化學(xué)成分具有抗氧化作用，能直接清除活性氧，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]；可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[8]，抑制呼吸道炎癥[9]，防治肺癌[10]。目前關(guān)于人參-五味子配伍治療IPF的作用機(jī)制尚缺乏研究，本文立足中醫(yī)藥辨證論治理論，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘理論方法，探索人參-五味子藥對治療IPF的潛在分子機(jī)制，以期為IPF的治療提供新的靶點(diǎn)與方向。

1 材料與方法

1.1 特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化靶標(biāo)基因挖掘篩選

以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞檢索人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)(http://www.genecards.org/)、比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database，CTD)(http://ctdbase.org/)以及高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus data base，GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得IPF治療靶標(biāo)基因。從GEO數(shù)據(jù)庫獲得了編號GSE24206、GSE44723兩個基因芯片的原始數(shù)據(jù)及對應(yīng)的GPL基因注釋文件，通過R語言多矩陣平均分析算法對基因芯片進(jìn)行原始數(shù)據(jù)背景校正歸一化處理，以表達(dá)差異檢驗(yàn)P<0.05、差異表達(dá)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)絕對值>2為條件，運(yùn)行Limma程序包[11]篩選獲得顯著差異表達(dá)的IPF靶標(biāo)基因。

1.2 人參-五味子藥對活性成分篩選及作用靶標(biāo)預(yù)測

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺[12](Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別獲取中藥人參、五味子的全部化學(xué)成分，根據(jù)口服中藥的藥代動力學(xué)ADME[13]參數(shù)篩選藥對有效活性成分。設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選藥對有效活性成分，并收集其作用靶標(biāo)基因，使用蛋白組數(shù)據(jù)庫[14](UniProt Knowledgebase，UniProtKB)(https://www.uniprot.org)對靶標(biāo)基因進(jìn)行基因符號Gene Symbol標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.3 基因映射及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將GeneCards、CTD及GEO獲得的IPF靶標(biāo)基因分別整理，使用R語言VennDiagram程序包對藥對有效活性成分作用靶標(biāo)基因與上述獲得的IPF靶標(biāo)基因取交集，獲得藥對調(diào)控的IPF靶標(biāo)基因。將人參-五味子藥對、有效活性成分及其調(diào)控的IPF靶標(biāo)基因?qū)刖W(wǎng)絡(luò)可視化分析軟件Cytoscape 3.6.1進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。分別以不同的節(jié)點(diǎn)表示中藥、活性成分及靶標(biāo)基因，節(jié)點(diǎn)間以邊線相聯(lián)系代表其從屬或作用關(guān)系。

1.4 靶標(biāo)基因互相作用關(guān)系分析及關(guān)鍵基因篩選

將藥對調(diào)控的IPF靶標(biāo)基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中各靶標(biāo)基因的度值(degree)大小篩選出其中的關(guān)鍵基因。關(guān)鍵基因是與較多其他靶標(biāo)基因發(fā)生相互作用的基因，可能是多個相關(guān)通路調(diào)控多基因發(fā)揮多靶點(diǎn)作用的樞紐，在疾病治療的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

1.5 分子對接驗(yàn)證

分子對接驗(yàn)證是通過將藥物化合物分子與基因分子進(jìn)行三維化合結(jié)構(gòu)的結(jié)合，計算其分子對接消耗的能量，以評估分子間穩(wěn)定結(jié)合的潛力[15]。本研究通過對人參-五味子調(diào)控IPF的關(guān)鍵基因及其相互作用的藥對活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，評估藥對活性成分調(diào)控IPF關(guān)鍵靶標(biāo)基因的結(jié)合潛力。首先從基因蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)[16]檢索關(guān)鍵基因的三維化合結(jié)構(gòu)，下載保存為PDB文件；從有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[17]獲取藥對活性成分三維結(jié)構(gòu)SDF文件，通過OpenBabel軟件轉(zhuǎn)化為MOL2文件；將關(guān)鍵基因的PDB文件上傳至分子對接預(yù)測數(shù)據(jù)庫SwissDock(http://www.swissdock.ch/)[18]作為對接主體，將藥對活性成分MOL2文件上傳作為配體，進(jìn)行分子對接預(yù)測分析。

1.6 基因本體與信號通路富集分析

采用R語言生物信息學(xué)分析Bioconductor工具包對關(guān)鍵基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)[19]生物學(xué)注釋過程富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[20]信號通路富集分析，預(yù)測人參-五味子治療IPF的潛在分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化靶標(biāo)基因

GSE24206、GSE44723基因芯片共包含22例IPF病人與10例正常組病人的肺組織樣本測序數(shù)據(jù)，運(yùn)行Limma包對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，共篩選獲得140個顯著差異表達(dá)基因，其中差異倍數(shù)(fold change,FC)>2的上調(diào)基因78個，F(xiàn)C<-2的下調(diào)基因62個。根據(jù)P值及FC值繪制差異基因表達(dá)火山圖(圖1(a))。以“idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞于GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫檢索分別獲得2754、2395個IPF疾病靶標(biāo)基因。

2.2 人參-五味子藥對活性成分及作用靶標(biāo)基因

在TCMSP平臺分別檢索人參、五味子的活性成分，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的藥代動力學(xué)參數(shù)篩選獲得藥對有效活性成分42個，對應(yīng)不同疾病靶標(biāo)基因92個。將獲得的藥對靶標(biāo)基因與上述獲得的IPF疾病靶標(biāo)基因通過VennDiagram程序包取交集，獲得藥對調(diào)控IPF靶標(biāo)基因48個，見圖1(b)。共有23個藥對有效活性成分參與調(diào)控上述48個IPF靶標(biāo)基因，如表1所示。

圖1 人參-五味子藥對活性成分調(diào)控IPF靶點(diǎn)基因Fig.1 IPF target genes of Ginseng Radix Et Rhizoma-Schisandrae Chinensis Fructus couple medicine

序號成分代碼成分名稱OB/%DL來源1MOL002879己二酸二異辛酯43.590.39人參2MOL000449豆甾醇43.830.76人參3MOL000358β-谷甾醇36.910.75人參4MOL003648高麗槐素65.830.54人參5MOL000422山柰酚41.880.24人參6MOL005308阿樸天仙子堿66.650.22人參7MOL005318石竹胺40.450.2人參8MOL005320花生四烯酸45.570.2人參9MOL005321佛丁酮A65.90.34人參10MOL005344人參皂苷rh236.320.56人參11MOL005348人參皂苷-Rh4苷元31.110.78人參12MOL005356吉九里香堿61.220.31人參13MOL005376人參萜二醇33.090.79人參14MOL005384蘇卡內(nèi)酯57.520.56人參15MOL005399胡蘿卜甙36.910.75人參16MOL000787藍(lán)堇堿59.260.83人參17MOL005317脫氧三尖杉酯堿39.270.81共同18MOL008957五味子素B30.710.83五味子19MOL008968五味子醇A30.690.78五味子20MOL008978五味子醇R34.840.86五味子21MOL008992五味子素C46.270.84五味子22MOL009213五味子木脂素B30.630.84五味子23MOL009220新南五味子素33.350.88五味子

2.3 藥對-活性成分-靶標(biāo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化

將人參-五味子藥對、23個有效活性成分及48個IPF靶標(biāo)基因共同導(dǎo)入至Cytoscape軟件中，構(gòu)建藥對-活性成分-靶標(biāo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果輸出為可視化網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含73個節(jié)點(diǎn)和144條邊線，共同構(gòu)成復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖2 人參-五味子藥對-活性成分-IPF靶標(biāo)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Network of Ginseng RadixEt Rhizoma-Schisandrae Chinensis Fructus couple medicine-active ingredients-IPF target genes

2.4 靶標(biāo)基因互相作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因篩選

將48個IPF靶標(biāo)基因上傳至STRING網(wǎng)站，設(shè)置物種為“Homo sapiens”(人類)，最小互作分?jǐn)?shù)為0.4，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，使用R語言對靶標(biāo)基因在網(wǎng)絡(luò)中的度值進(jìn)行統(tǒng)計，根據(jù)度值大小進(jìn)行排序，篩選其中度值最高的前20位靶標(biāo)基因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵基因，并以條形圖呈現(xiàn)，見圖3。

圖3 靶標(biāo)基因度值排序(前20位)Fig. 3 Sequence diagram of target genes′ degree (Top 20)

2.5 關(guān)鍵基因GO富集分析

將關(guān)鍵基因進(jìn)行整理，使用R語言clusterProfiler程序包進(jìn)行GO生物學(xué)注釋過程富集分析，篩選檢驗(yàn)統(tǒng)計P<0.05的基因產(chǎn)物注釋過程，并按照P值從小到大進(jìn)行排序，以可視化圖形展示排名前20位的GO過程。如圖4所示，關(guān)鍵基因主要富集于核受體活性、類固醇激素受體活性、血紅素結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、Hsp90蛋白結(jié)合等GO生物學(xué)過程。

圖4 關(guān)鍵基因GO富集結(jié)果(前20)Fig.4 Enriched GO processes of hub genes(Top 20)

2.6 關(guān)鍵基因KEGG信號通路富集分析

運(yùn)行R語言clusterProfiler程序包對關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，設(shè)置物種歸屬為“hsa”(人類)，以Benjamini校正法對富集通路檢驗(yàn)統(tǒng)計進(jìn)行校正，篩選P<0.05的通路并根據(jù)P值從小到大排序，列表展示富集程度最高的前10個信號通路，見表2。

表2 關(guān)鍵基因KEGG信號通路富集分析(前10位)Table 2 Enriched KEGG pathways of hub genes (Top10)

2.7 分子對接分析

本研究通過SwissDock平臺將排名前5位的關(guān)鍵基因(AKT1、PTGS2、IL1B、MAPK8、CASP3)與其相互作用的人參-五味子活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，結(jié)果見表3。關(guān)鍵基因與藥對活性成分分子對接能量ΔG大致波動在-26～-40 kJ/mol范圍內(nèi)，認(rèn)為兩者總體能穩(wěn)定對接結(jié)合，是人參-五味子有效調(diào)控IPF關(guān)鍵基因的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 分子對接驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Results of molecular docking

3 討論

中醫(yī)學(xué)將IPF歸于“肺萎”范疇，《金匱要略心典》總結(jié)“痿者萎也，如草木之萎而不榮，為津爍而肺焦也”，指出肺萎的根本病機(jī)為肺臟氣陰虧損。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載 “人參，味甘微寒，主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄”，《本草別錄》記載“五味子，養(yǎng)五臟，除熱，生陰中肌“，人參-五味子是經(jīng)典的益氣養(yǎng)陰藥物配伍，被廣泛應(yīng)用于氣陰虧損所致的喘逆哮咳等呼吸系統(tǒng)疾病的治療中[21]，在IPF治療中具有良好的前景。

本研究立足中醫(yī)辨證論治觀念，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，共篩選出人參-五味子藥對含有人參萜二醇、五味子素B等23個有效活性成分，作用于48個IPF靶標(biāo)基因，通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從調(diào)控免疫功能、抑制纖維化、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥等幾方面發(fā)揮治療IPF的作用。

活性成分山奈酚分別與NOS2、PTGS1、PTGS2等多個靶標(biāo)基因發(fā)生相互作用，是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的活性成分，研究認(rèn)為山奈酚具有抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激的作用[22]，PTGS1、PTGS2是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶同工酶，山奈酚可能通過PTGS1、PTGS2參與上調(diào)炎癥產(chǎn)物環(huán)氧合酶(COX-2)表達(dá)，促進(jìn)抗纖維化代謝產(chǎn)物 PGE2生成，發(fā)揮抗IPF作用[23]；生物利用度較高的吉九里香堿具有抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等保護(hù)作用[24]；人參皂苷Rh2通過調(diào)控IL1B介導(dǎo)的免疫反應(yīng)改善機(jī)體免疫功能[25]；人參、五味子共有成分脫氧三尖杉酯堿在肺癌相關(guān)研究中表現(xiàn)出良好的肺間質(zhì)細(xì)胞保護(hù)特性[26]。

關(guān)鍵基因富集的KEGG信號通路結(jié)果顯示，富集基因數(shù)目最多、顯著性最高的白介素17信號通路，下游通路中由多種IL-17亞家族蛋白參與調(diào)控CD4+、CD8+等多種T淋巴細(xì)胞的增殖凋亡及自身免疫反應(yīng)，關(guān)鍵基因IFNG、IL-1B等共同參與不同環(huán)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。相關(guān)研究表明，IPF患者外周血中IL2、血清干擾素IFNG水平明顯下降，CD4+淋巴細(xì)胞比例下降，CD8+淋巴細(xì)胞增加，免疫功能明顯紊亂，可能與IL-17信號通路的調(diào)控密切相關(guān)[27]。關(guān)鍵基因PPARG富集于過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路，PPAR屬于核受體超家族，其下游活化可產(chǎn)生抗炎、調(diào)控代謝活動等效應(yīng)。有研究表明，PPARG配體可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)對肺成纖維細(xì)胞的活化刺激及膠原蛋白的分泌，抑制氧化應(yīng)激損傷[28]。劉豹等[29]研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方劑麥門冬湯含有PPARG激活劑，有助于抑制IPF肺纖維化進(jìn)程。炎癥反應(yīng)可能是IPF發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[30]，關(guān)鍵基因在腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、核因子KB(NF-kappa B)及TGF信號通路等經(jīng)典炎癥相關(guān)通路中均有較顯著的富集。研究表明TGF-β、TNF-α是促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)鍵炎癥因子，并可介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡壞死，益氣養(yǎng)陰方劑在IPF大鼠模型試驗(yàn)中降低TGF-β、TNF-α的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[31]。

本研究通過預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)人參-五味子的23個活性成分參與調(diào)控48個IPF疾病靶點(diǎn)基因，其中的關(guān)鍵基因AKT1、PTGS2、IL1B、MAPK8、CASP3等可能通過參與IL17、PPAR、TNF信號通路等在調(diào)控免疫功能、抑制纖維化、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥等幾方面發(fā)揮抗IPF的作用，人參-五味子治療IPF存在多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。但本研究僅基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)測分析，不涉及藥物成分在機(jī)體的代謝變化及協(xié)調(diào)作用，存在一定局限性，后續(xù)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證人參-五味子抗IPF的具體作用機(jī)制。